孔令華

摘? 要：為了解某地方品種雞群沙門氏菌病的流行病學(xué)及病原學(xué)特征，為防治沙門氏菌提供數(shù)據(jù)支持。本研究從某地方品種雞群的胎糞樣品、水線乳頭和環(huán)境拭子共采集105份樣品，進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定。結(jié)果顯示：共分到25株沙門氏菌，所有采集的樣品中沙門氏菌的分離率為23.81%，且分離株均為雞白痢沙門氏菌。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;胎糞;雞白痢沙門氏菌;地方品種

中圖分類號：S858.31? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2020）11-0047-03

沙門氏菌是一種常見的、傳播途徑廣泛的食源性病原菌，可以垂直或水平傳播[1]。沙門氏菌病是與獸醫(yī)公共衛(wèi)生密切相關(guān)的重要的一類人獸共患病。根據(jù)病原學(xué)特點分為雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒[2]。家禽感染沙門氏菌后會導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降、種蛋孵化率降低等，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。雞白痢沙門氏菌對各個品種的雞均易感，主要感染2～3周齡的雛雞，流行性高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的威脅[4]。

本研究通過對某地方品種雞群采集環(huán)境拭子和胎糞樣品進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，了解和監(jiān)測該雞群雞白痢沙門氏菌的感染狀態(tài)，同時為種禽場雞白痢凈化工作提供了參考。

1? 材料與方法

1.1? 試劑? 緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基（SC）、四硫磺酸鹽煌綠培養(yǎng)基（TTB）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD），均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;2×Taq Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DuRed，購自核酸染料北京泛博生物化學(xué)有限公司;酵母提取粉、胰蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，均購自天際時開通化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉，購自北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖，購自南京生興生物科技有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的來源? 2020年10月從某地方品種雞場收集環(huán)境拭子、水線乳頭和胎糞樣品共105份，其中環(huán)境拭子30份、水線乳頭5份及胎糞樣品70份。

1.2.2? 沙門氏菌的分離鑒定? 無菌條件下將環(huán)境拭子棉棒放入4.5 mL BPW，水線乳頭取500 μL加入4.5 mL BPW混合，稱取0.5 g胎糞樣品裝入到含有4.5 mL BPW滅菌搖管，置于搖床中，37 ℃、220 rpm培養(yǎng)8～12 h。將0.5 mL BPW增菌液分別轉(zhuǎn)入4.5 mL SC和TTB中，37 ℃、220 rpm培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)蘸取TTB和SC增菌液后劃線接種于XLD瓊脂平板，放置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。

在XLD平板上挑取3～5個疑似沙門氏菌的黑色或無色透明、光滑圓潤單菌落，加入500 μL LB液體培養(yǎng)基增菌6 h。選擇沙門氏菌特異性引物FimW確認(rèn)[5]。引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用LB菌液作為模板，擴增體系共25 μL，包括：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（F/R）各1 μL，菌液1 μL，無菌雙蒸水9.5 μL。FimW反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。吸取PCR產(chǎn)物8 μL使用1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行凝膠成像觀察結(jié)果。

1.2.3? 雞白痢沙門氏菌PCR鑒定? 選取經(jīng)FimW引物PCR確定為沙門氏菌的陽性樣品菌液作為模板，分別使用雞白痢沙門氏菌特異性引物IpaJ和SEP進(jìn)行PCR擴增，STN基因引物作為沙門氏菌鑒定通用引物。25 μL反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)/R各1 μL，菌液1 μL，剩余用無菌雙蒸水補齊。IpaJ反應(yīng)程序為：94 ℃ 10 min（預(yù)變性），94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min（延伸），共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min（延伸），4 ℃保存。SEP和STN反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性10 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)擴增35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增結(jié)束后取8 μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。引物序列見表1。

2? 結(jié)果

2.1? 沙門氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果? 本研究從某地方品種雞群共采集樣品105份，共分離鑒定出25株沙門氏菌，陽性檢出率為23.81%，其中從環(huán)境拭子中分離到1株沙門氏菌，分離率為3.33%;胎糞樣品中分離到24株沙門氏菌，陽性率為34.28%。沙門氏菌分離情況見表2。

2.2? 沙門氏菌的培養(yǎng)特性? 在XLD瓊脂平板上的疑似沙門氏菌呈現(xiàn)為無色透明、飽滿、光滑圓潤的菌落;在普通的LB平板上呈現(xiàn)出圓潤、微隆起、半透明狀的菌落。

2.3? PCR鑒定? 電泳凝膠成像結(jié)果顯示：在105個樣品中，共檢出25個陽性樣品;目的片段大小在495 bp左右，PCR擴增結(jié)果與目的條帶相符合。部分樣品PCR鑒定結(jié)果見圖1。

2.4? 雞白痢沙門氏菌PCR鑒定? 雞白痢沙門氏菌特異性引物IpaJ、SEP和STN凝膠成像，見圖2。

如圖2所示，在25個沙門氏菌樣品中，25株沙門氏菌均為雞白痢沙門氏菌，其中共檢出13個IpaJ陽性樣品，IpaJ陽性率為52%;SEP和STN陽性檢出率為100%（25/25）。目的條帶大小分別為740 bp、573 bp和260 bp，陽性樣品特異性條帶與目的條帶相符合。

3? 討論

雞沙門氏菌病在我國養(yǎng)雞行業(yè)廣泛存在，其危害貫穿整個養(yǎng)殖周期，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益下降等一系列問題[6]。因此，對沙門氏菌的流行和感染狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測具有十分重要的意義。本研究從環(huán)境拭子、水線乳頭和胎糞中分離鑒定得到25株沙門氏菌，陽性率為23.81%，高于信素華等人在廣西部分雞場從雞胚樣品中對沙門氏菌13.95%（18/139）的分離率[7]，也高于王迪軒等人從華中地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)殖場中采集的3724份樣品分離到124株沙門氏菌的陽性率（3.33%）[8]。本研究結(jié)果表明，該地方品種雞群沙門氏菌病流行和污染狀態(tài)較為嚴(yán)重，了解這一情況對于該雞群雞白痢凈化工作具有十分重要的指導(dǎo)意義。

雞白痢是家禽中重要的一類細(xì)菌性疾病，主要感染雛雞，導(dǎo)致種蛋受精率、孵化率降低，嚴(yán)重制約養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。本研究通過雞白痢沙門氏菌特異性引物PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，25株沙門氏菌均為雞白痢沙門氏菌，這一結(jié)果與史瑞雅等人在河北部分地區(qū)從132份病料樣品分離到48株沙門氏菌（36.36%）且雞白痢沙門氏菌是唯一血清型的結(jié)果相似[9]。本研究對25株分離株進(jìn)行雞白痢特異性引物IpaJ PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，共檢出13個IpaJ陽性菌株，IpaJ陽性率為52%（13/25），具體原因有待于進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

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[8]? 王迪軒，高東陽，張?zhí)熳耍?華中地區(qū)雞源沙門菌分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（03）：931-939.

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