蒲思思 周朝輝 賈能勤

摘要：癌癥死亡患者中有90%由癌癥轉(zhuǎn)移引起，研究表明：患者的外周血、胸腔液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）與癌癥轉(zhuǎn)移及腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期密切相關(guān).因此，CTC檢測(cè)在實(shí)體腫瘤前期診斷、預(yù)后及療效評(píng)估等方面扮演著舉足輕重的角色，該綜述基于CTC區(qū)別于正常細(xì)胞的物理學(xué)、電學(xué)、生物學(xué)特征，總結(jié)了目前CTC分離富集及分析檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，并就國(guó)內(nèi)外CTC檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論，對(duì)其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望.

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）;CTC檢測(cè);分離富集

中圖分類(lèi)號(hào)：O6-1;R 730.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-5137（2020）02-0219-15

0引 言

在1869年，ASHWORTH[]首次報(bào)道了血液中存在與其患者腫瘤具有相同大小、形狀和外觀(guān)的上皮腫瘤細(xì)胞，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）.在實(shí)體腫瘤部位，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮至間充質(zhì)的轉(zhuǎn)換（EMT），E-鈣黏連蛋白表達(dá)降低，腫瘤細(xì)胞脫離，隨后內(nèi)滲進(jìn)入血管.多數(shù)CTC發(fā)生凋亡或被吞噬，只有不足0.01%的CTC可逃過(guò)人體自身免疫的捕殺，而腫瘤微栓子（CTM）的集體遷移及更高的存活率，使其更具有轉(zhuǎn)移和侵襲的潛力[2].CTC隨著循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)端器官，再外滲出血管，找到合適的“土壤”，并發(fā)生黏附，進(jìn)行間充質(zhì)至上皮的轉(zhuǎn)換（ MET），開(kāi)始血管的生成及腫瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，繼而發(fā)展成實(shí)體腫瘤，形成致死性轉(zhuǎn)移[3].擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞甚至可以循環(huán)到骨髓中，并休眠于此，數(shù)年后，重新進(jìn)入血液形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移[4].

目前，腫瘤診斷嚴(yán)重依賴(lài)于影像學(xué)檢測(cè)和組織切片，腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能，由此可見(jiàn)，CTC檢測(cè)對(duì)于癌癥的早期診斷，以及檢測(cè)患者的術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評(píng)估療效與預(yù)后、選擇合適的個(gè)體化治療等方面具有重要的臨床意義，且能幫助理解CTC在外周血中的存活、吸附、侵襲等生物學(xué)行為，破譯腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，通過(guò)綜述CTC富集技術(shù)及分析檢測(cè)技術(shù)，深入探討了CTC檢測(cè)的研究進(jìn)展及其面臨的挑戰(zhàn)，并對(duì)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)做出展望.

1 CTC分離富集技術(shù)

1.1 物理特性富集法

1.1.1基于尺寸差異分離富集

“不死”腫瘤細(xì)胞的異常增殖，使其區(qū)別于正常細(xì)胞，具有較大的核質(zhì)比及細(xì)胞尺寸，且不同腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞平均直徑與白細(xì)胞直徑的比率不同[5].而白細(xì)胞和紅細(xì)胞等正常血液細(xì)胞的尺寸較腫瘤細(xì)胞小，紅細(xì)胞直徑約為4～8 um，白細(xì)胞尺寸約為6～19 um.該差異為基于細(xì)胞尺寸差異的無(wú)生物標(biāo)記的分離富集提供可能，

基于尺寸的分離富集常采用8um孔徑的臨界尺寸（D），有效截留CTC，過(guò)濾除去尺寸較小的紅細(xì)胞、白細(xì)胞.2011年，TIBBE等;[6]在上皮腫瘤細(xì)胞過(guò)濾技術(shù)（ISET）平臺(tái)，采用氫氧化鈉刻蝕法制備具有8um孔徑的聚碳酸酯膜分選CTC，在4h內(nèi)成功分離肺癌患者外周血中的CTC和CTM.為避免ISET技術(shù)中孔不均勻密度分布的缺點(diǎn)[7]，具有體積小、易加工、無(wú)毒及易自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)的微小型裝置被廣泛研究，如新月形隔離微結(jié)構(gòu)的微裝置[8]、柔性微彈簧陣列裝置[9]、蛇紋通道的微裝置[10]等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTC的高通量、高靈敏檢測(cè).ZHENG等[11]采用濕法刻蝕設(shè)計(jì)了圓形孔（D=11 um）的聚對(duì)二甲苯膜微過(guò)濾器裝置，用于捕獲和電解人血液CTC，同時(shí)利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行基因組分析.除膜過(guò)濾，基于細(xì)胞尺寸差異捕獲的微流控芯片分離富集技術(shù)也廣受關(guān)注[12-14].如圖l所示，KIM等[15]通過(guò)離心處理血樣后，利用CAVl-EpCAM偶聯(lián)的微球，增大CTC與白細(xì)胞的尺寸差異，結(jié)合具有狹縫陣列的微流控芯片，自動(dòng)化分離富集CTC.

基于細(xì)胞尺寸差異進(jìn)行過(guò)濾富集CTC的技術(shù)避開(kāi)了依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原EpCAM的分離富集技術(shù)的局限，但在臨床應(yīng)用中也有缺陷.COUMANS等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、直腸癌患者、前列腺癌患者的全血中捕獲的CTC平均直徑為13.1，11.0，10.7 um，比相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞直徑小.PARK等[17]研究發(fā)現(xiàn)，相比于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的前列腺癌（prostate）細(xì)胞（13.38+2.54 um），從前列腺癌患者外周血中分離出來(lái)的CTC具有更小的尺寸（7.97+1.81 um），并且形狀更細(xì)長(zhǎng)，核質(zhì)比也更高，因此，腫瘤細(xì)胞尺寸及其形變能力的異質(zhì)性，使得基于細(xì)胞尺寸差異的分選方法具有較低的特異性及靈敏性，且過(guò)濾高濃度的顆粒物容易導(dǎo)致堵塞.

1.1.2密度梯度分離（DGC）

對(duì)于復(fù)雜的人類(lèi)外周血，在每毫升約l07～109個(gè)血液細(xì)胞中，除了極少量的CTC以外，還有大量的紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，其密度各有不同，紅細(xì)胞密度為1.10—1.15 g ·mL-1，白細(xì)胞密度為1.07—1.09 g·mL-1，而腫瘤細(xì)胞的密度相對(duì)白細(xì)胞較低，基于Stokes-Einstein公式，采用一定密度的等滲溶液，如Ficoll或Percoll細(xì)胞分離液，進(jìn)行密度梯度離心，將目標(biāo)細(xì)胞分離開(kāi)來(lái).

作為標(biāo)準(zhǔn)化的血液細(xì)胞分離方法，密度梯度離心雖操作簡(jiǎn)單、成本低廉，但回收率低，且CTC純度低.GERTLER等[18]將新型密度梯度離心系統(tǒng)OriCoQuiCkTM與標(biāo)準(zhǔn)密度梯度離心系統(tǒng)Ficoll進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)改良的OncoQuickTM密度梯度離心系統(tǒng)，結(jié)合基于CTC尺寸差異分離方法，于離心管中放人多孔的過(guò)濾膜，從10 mL血液中分離出9.5 xl04個(gè)單核細(xì)胞，只需轉(zhuǎn)移到1～2個(gè)載玻片上進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估，極大地減少了工作量，且提高了CTC檢出率.2004年，LARA等[19]研究者結(jié)合密度梯度離心、陰性磁分選及過(guò)濾法富集CTC.先密度梯度離心除去大量的紅細(xì)胞，再用免疫磁分選除去大量的白細(xì)胞，最后通過(guò)過(guò)濾法過(guò)濾得到目標(biāo)細(xì)胞CTC，如圖2所示.該方法有效避免了腫瘤細(xì)胞的密度異質(zhì)性，將白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞成功地區(qū)分開(kāi)來(lái).

1.1.3介電泳場(chǎng)流分級(jí)分離（depFFF）

腫瘤細(xì)胞的特殊組成、形態(tài)及表型使其介電特性異于紅細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等血液細(xì)胞的介電性質(zhì).當(dāng)腫瘤細(xì)胞與血液細(xì)胞暴露在交變電場(chǎng)中，會(huì)發(fā)生不同的極化現(xiàn)象，從而具有不同的電動(dòng)效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域分布，此時(shí)若再施加適當(dāng)?shù)耐獠苛?，通常通過(guò)流體流動(dòng)，洗除陰性細(xì)胞，便可截留下目標(biāo)細(xì)胞，這樣的方法即是基于CTC介電異質(zhì)性分離富集CTC的介電泳場(chǎng)流分級(jí)分離.

1995年，BECKER等[20]采用17.6 mmX55.O mm電極陣列的depFFF腔室，如圖3所示，利用介電親和力成功分離MDA-231乳腺癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了95%以上的回收率.通過(guò)斷開(kāi)電壓釋放被電泳力（DEP）截留的CTC，釋放的CTC細(xì)胞活性大于98%，并且對(duì)CTC的生長(zhǎng)能力幾乎沒(méi)有影響.1997年，GASCOYNE等[21]細(xì)化并擴(kuò)展了通過(guò)介電親和力進(jìn)行細(xì)胞分選的原理，并得出了可以評(píng)估最佳細(xì)胞分選條件和效率的表達(dá)式.2009年，GASCOYNE等[22]設(shè)計(jì)了帶有3 000個(gè)相互交錯(cuò)的銅金電極元件的depFFF腔室（0.6 mmx25 mmx300mm），實(shí)現(xiàn)了模擬小樣本的90%以上的腫瘤細(xì)胞回收率，并且能在15 min內(nèi)完成細(xì)胞分離.

基于腫瘤細(xì)胞介電特性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞不同亞型的分離，且不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行任何的修飾或處理，對(duì)CTC下游分析來(lái)說(shuō)，這是關(guān)鍵且重要的.depFFF相比于磁分選，其分選效率、回收率都較高，通過(guò)該方法分離富集的未經(jīng)標(biāo)記的活腫瘤細(xì)胞可用于培養(yǎng)，并進(jìn)行所有分子類(lèi)型的分析檢測(cè).depFFF也可作為常規(guī)方法的輔助手段，以提高診斷和細(xì)胞分離應(yīng)用的總體分辨率、速度和效率.

1.2親和性富集法

1.2.1磁分選富集技術(shù)

區(qū)別于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面會(huì)上調(diào)或下調(diào)相關(guān)抗原、蛋白質(zhì)表達(dá)量，如上皮腫瘤細(xì)胞表面的上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）、乳腺癌細(xì)胞表面人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等，而正常細(xì)胞表面低表達(dá)，甚至不表達(dá).再如白細(xì)胞表面特異性表達(dá)白細(xì)胞共同抗原（如CD45抗原），則在腫瘤細(xì)胞中不表達(dá).磁分選富集技術(shù)，即基于這樣的生物學(xué)特征，在具有超順磁性的顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，如抗一上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM抗體/anti-EpCAM）、靶向腫瘤細(xì)胞，在外加磁場(chǎng)的作用下，腫瘤細(xì)胞被吸引而滯留在磁場(chǎng)中，從而分離出目標(biāo)細(xì)胞（陽(yáng)性分選），或是通過(guò)抗白細(xì)胞共同抗原的CD45抗體移除血液中的白細(xì)胞、巨核細(xì)胞及血小板（陰性分選）.基于免疫學(xué)方法對(duì)CTC進(jìn)行富集，具有極高的特異性.

唯一被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的CellSearchTM（ Veridex）半白動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫鐵磁流體靶向CTC表面的EpCAM抗原，從全血中分選CTC，然后對(duì)CTC進(jìn)行腫瘤標(biāo)記染色并使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，能可靠地檢測(cè)出血液中的CTC，適用于臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的常規(guī)評(píng)估[23-24].且聯(lián)合抗一細(xì)胞角蛋白（CK抗體）、EpCAM抗體捕獲，能顯著提升CellSearch系統(tǒng)的靈敏度[24].此外，亦有多種技術(shù)平臺(tái)基于免疫磁分選技術(shù)富集CTC，如MagSweeper[25]、磁激活細(xì)胞分選技術(shù)（ MACS）[26].除了anti-EpCAM特異性識(shí)別分子，周朝輝等[27]設(shè)計(jì)了anti-EGFR抗體偶聯(lián)的免疫磁珠，結(jié)合磁分選技術(shù)與免疫熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)非小型肺癌細(xì)胞A549的檢測(cè)，

以上方法均在體外捕獲CTC，2008年哈佛醫(yī)學(xué)院的VERMESH等[28]開(kāi)發(fā)了柔性磁力“魚(yú)線(xiàn)”（MagWIRE），希望能直接在患者靜脈血管中富集CTC，如圖4所示，他們選擇在活豬的耳靜脈血管中模擬“磁釣”癌細(xì)胞，MagWIRE成功捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并且回收了34%的免疫磁珠，該“磁釣”CTC的回收率是體外磁分選CTC的10～80倍.

中國(guó)科學(xué)院國(guó)家納米科學(xué)中心研究院PENG等[29-31]開(kāi)發(fā)了擁有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新技術(shù)“腫瘤捕手”，通過(guò)篩選特異性多肽，并巧妙地組裝到納米磁珠表面，克服了抗體磁珠的位點(diǎn)少、方向性差、靶向性差的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在模擬血液中大于80%的CTC捕獲率，而傳統(tǒng)的抗體磁珠捕獲率僅在30%左右.2015年，中國(guó)科學(xué)院HUANG等[32]以免疫活細(xì)胞為生物模板，并結(jié)合表面化學(xué)，仿生制備了“Smart”免疫磁珠，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTC的高靶向效率，比商業(yè)化的磁珠（Dynabeads M280，Invitrogen）具有更高的捕獲率，并通過(guò)可切割的二硫鍵，按需釋放捕獲的活腫瘤細(xì)胞.

綜上所述，基于抗體一抗原識(shí)別的免疫磁分選技術(shù)具有極高的特異性，但也較為耗時(shí)耗財(cái)，由于其依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)，CTC的異質(zhì)性也影響了該技術(shù)對(duì)CTC的分選效率.

1.2.2微流控芯片技術(shù)

近年來(lái)，基于CTC物理特性和生化特性的免疫微流控芯片受到廣泛重視.2007年，NAGRATH等J33j構(gòu)筑了微柱“CTC-chip”芯片，通過(guò)化學(xué)方法將anti-EpCAM抗體修飾到微柱陣列表面，在116個(gè)癌癥患者中成功檢測(cè)出115個(gè)癌癥轉(zhuǎn)移患者，并在7例早期癌癥患者的外周血中均檢測(cè)到CTC，每毫升外周血中CTC數(shù)量在5～1 281個(gè)變化（純度為50%）.STOTT等[34]設(shè)計(jì)的人骨形免疫（anti-EpCAM）芯片“HB-Chip”，從15位轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中檢測(cè)出14位的外周血中有CTC（檢出率為93%）.麻省理工學(xué)院的PARK等J35J將金納米顆粒應(yīng)用到HB-Chip芯片中（NP-HBCrC-C}iip），采用谷胱甘肽（GSH）通過(guò)化學(xué)配體交換實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，釋放高活性的CTC，為后續(xù)的RNA基因測(cè)序等研究提供便利.改良的人骨形芯片的微通道使流體產(chǎn)生微渦流，以增加腫瘤細(xì)胞與芯片表面抗體的接觸機(jī)會(huì)，從而實(shí)現(xiàn)了高通量、高靈敏及高特異性的捕獲CTC，且能檢出之前不被重視的細(xì)胞團(tuán)簇.2014年，KARABACAK等[36]設(shè)計(jì)的CTC-iChip芯片利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理及慣性聚焦，在一個(gè)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)兩步法分選CTC，如圖5所示，在模組1利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理，將血液紅細(xì)胞進(jìn)行分離棄除;在模組2使用磁泳法分離出CD45功能化磁珠標(biāo)記的白細(xì)胞，分選CTC.CTC-iChip可處理8 mL·h-1全血，回收（97±2.7）%的癌細(xì)胞，

此外，捕獲界面的納米結(jié)構(gòu)在微流控芯片中也被廣泛研究.如利用混沌混合器使流體產(chǎn)生垂直流向，結(jié)合二氧化硅（ Si02）三維納米結(jié)構(gòu)高效捕獲CTC[37].2018年CUI等[38]通過(guò)正硅酸四乙酯原位水解法，在生物芯片表面生長(zhǎng)Si02納米陣列，以促進(jìn)生物芯片與CTC微絨毛及絲狀偽足之間的地形相互作用，協(xié)同特異性靶向作用捕獲CTC.實(shí)驗(yàn)證明，相比光滑的表面，納米線(xiàn)修飾的具有納米結(jié)構(gòu)的表面對(duì)CTC具有更高的捕獲率（85.4±8.3）%.如圖6所示，人體前列腺癌細(xì)胞PC-3與光滑表面的接觸面積很小，而在納米三維結(jié)構(gòu)的界面上，PC-3伸出更多偽足與界面相互作用，并鋪展開(kāi)來(lái)，

相比于傳統(tǒng)方法，微流控芯片結(jié)合親和分選方法，利用流體動(dòng)力學(xué)分離細(xì)胞，具有更高的分辨率和靈敏度，易實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTC分選及檢測(cè)工作，操作簡(jiǎn)單高效，且盡可能地避免了人為誤差，但該方法與免疫磁分選類(lèi)似，篩選靶向目標(biāo)細(xì)胞的特異性抗體是該技術(shù)難點(diǎn)及瓶頸.

2 CTC的分析檢測(cè)技術(shù)

2.1 免疫熒光染色檢測(cè)

免疫熒光檢測(cè)法作為傳統(tǒng)CTC鑒定方法，即將熒光素偶聯(lián)的熒光抗體與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體抗原特異性反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，借此對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定及定位.在CeIISearch系統(tǒng)中，通過(guò)結(jié)合CD45綠色熒光抗體（靶向白細(xì)胞）、CK8/18/19紅色熒光抗體（靶向腫瘤細(xì)胞）與細(xì)胞核DAPI藍(lán)色熒光染色劑對(duì)CTC進(jìn)行熒光識(shí)別鑒定[23-24].具有紅色和藍(lán)色熒光，無(wú)綠色熒光（CK+/CD45-/DAPI+）的細(xì)胞鑒定為CTC，具有綠色和藍(lán)色熒光，無(wú)紅色熒光（CK-/CD45+/DAPI+）的細(xì)胞則是白細(xì)胞，如圖7所示[39].該方法是大部分實(shí)驗(yàn)室采用的CTC鑒定方法，通過(guò)免疫熒光鑒定CTC表面相關(guān)特異性蛋白的表達(dá)，該檢測(cè)方法具有耐污染的優(yōu)勢(shì)，但易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，且操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力，因此不宜大規(guī)模使用.

2.2核酸分析檢測(cè)

近年來(lái)，基于CTC中核酸的分子分析方法被不斷開(kāi)發(fā)用于CTC鑒定，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）作為一種被廣泛使用的檢測(cè)手段，可在106個(gè)白細(xì)胞的復(fù)雜背景下檢測(cè)到一個(gè)CTC，并定量CTC相關(guān)基因的表達(dá)情況.CK-19-mRNA作為CTC的特異性核酸序列，是RT-qPCR定量檢測(cè)的普遍目標(biāo)[40].STATHOPOULOU等[41-42]采用LightCyclerTM（Roche）系統(tǒng)，通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增引物，實(shí)時(shí)地定量檢測(cè)外周血中CK-19-mRNA，極大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏性.Multiplex-RT-qPCR可以在一個(gè)樣本中同時(shí)評(píng)估多個(gè)目標(biāo)分子（如：EpCAM，MUC-1，HER2等），這有利于對(duì)有限的CTC進(jìn)行更高靈敏度的檢測(cè)[43]，如圖8所示，甲基化特異性基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MSP）的出現(xiàn)也證明了CTC多參數(shù)檢測(cè)的重要性[44]，

通過(guò)熒光素標(biāo)記的DNA探針與CTC細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，從而獲得核內(nèi)染色體或基因拷貝狀態(tài)的相關(guān)信息的熒光原位雜交（FISH）法，可用于評(píng)估乳腺癌、前列腺癌患者CTC中的HER2的表達(dá)情況[45-46]，及ALK基因的復(fù)制數(shù)量[47].相比于PCR，F(xiàn)ISH具有較高的抗污染能力，且重復(fù)性好.

總之，相比于免疫熒光成像，核酸分析更客觀(guān)、可量化、成本低，不需要專(zhuān)門(mén)的檢驗(yàn)師評(píng)估，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化.核酸檢測(cè)可以確定與治療相關(guān)的分子靶標(biāo)，如：基因突變、染色體易位等，從而指導(dǎo)患者的個(gè)性化治療.但是，由于CTC的異質(zhì)性，分子分析法無(wú)法對(duì)CTC個(gè)數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量.

2.3光學(xué)分析檢測(cè)

稀土發(fā)光材料的熒光信號(hào)亦被應(yīng)用于CTC檢測(cè).2015年，WANG等[37]結(jié)合上轉(zhuǎn)換磁性復(fù)合免疫材料（NaYF4-Fe3O4-Ab）及硅納米線(xiàn)整合的芯片，進(jìn)行CTC捕獲，實(shí)現(xiàn)近紅外（980 nm）上轉(zhuǎn)換熒光（UCL）成像.2019年，GUO等[48]結(jié)合時(shí)間分辨光致發(fā)光技術(shù)（TRPL技術(shù)）和稀土納米材料（NaEuF4-Ab）溶解增強(qiáng)熒光放大技術(shù)，通過(guò)100us的延遲，大大消除了短周期背景信號(hào)，提高了信噪比，首次實(shí)現(xiàn)了全血中CTC的高靈敏直接檢測(cè)，如圖9所示.

基于材料的熒光信號(hào)檢測(cè)，極大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，精準(zhǔn)靈敏，且較為客觀(guān).但由于該方法需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異性熒光材料的孵育，易造成樣品污染，細(xì)胞存活率也低.

2.4拉曼檢測(cè)

拉曼檢測(cè)多用于分子層面的檢測(cè)，近年來(lái)，由于拉曼檢測(cè)具有信號(hào)穩(wěn)定、檢測(cè)限低、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，其在CTC檢測(cè)領(lǐng)域被廣泛關(guān)注.利用特異性靶向磁珠及表面增強(qiáng)拉曼（SERS）探針與CTC形成三明治夾結(jié)構(gòu)是研究者普遍選擇的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTC的拉曼檢測(cè)[49-50].XUE等[51]則合成金納米粒子（Au NPs）包裹的超順磁性納米球（SPION-PEI），并采用巰基苯甲酸（MBA）、還原性牛血清蛋白（r-BSA）與葉酸（FA）進(jìn)行層層修飾，巧妙設(shè)計(jì)了SPION-PEI@Au NPs-MBA-r-BSA-FA復(fù)合SERS探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)宮頸癌患者的CTC（檢測(cè)限為1個(gè)·mL-I）的捕獲檢測(cè)及釋放，如圖10所示.

研究表明，該方法有效避開(kāi)了免疫熒光檢測(cè)的光降解及光漂白劣勢(shì)，靈敏度可以與RT-qPCR相媲美，制樣簡(jiǎn)單，測(cè)量高效準(zhǔn)確，但由于CTC在外周血中極少，這對(duì)SERS探針的設(shè)計(jì)提出了更高的要求，且設(shè)備昂貴.

2.5其他分析檢測(cè)方法

除上述CTC檢測(cè)方法，研究者亦將電化學(xué)傳感器應(yīng)用于CTC檢測(cè).如圖11所示，HU等[52]將通過(guò)生物模板法合成的牛血清蛋白包裹的銀納米微球（ Ag@BSA）負(fù)載于金電極上，構(gòu)筑了新型的細(xì)胞傳感器，靈敏檢測(cè)了人口腔表皮樣癌細(xì)胞（KB瘤細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)方法檢測(cè)CTC（檢測(cè)限：20個(gè)·mL-l KB細(xì)胞）.為提高電化學(xué)檢測(cè)靈敏度，QU等[53]構(gòu)建了一個(gè)兩種特異性適配體修飾（ss-TLSlc，ds-TLSlla）的超靈敏電化學(xué)傳感器.電化學(xué)檢測(cè)具有檢測(cè)方便、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，且易實(shí)現(xiàn)便攜式儀器檢測(cè)，在CTC檢測(cè)的臨床應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景.此外，其他檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ ELISA）也被應(yīng)用于CTC檢測(cè)[54].KIM等[55]利用四氧化三鐵（Fe304）納米顆粒及鉑（Pt）納米顆粒的協(xié)同催化效應(yīng)，將兩者負(fù)載在氧化石墨烯（GO）上，制備特異性抗體修飾的納米復(fù)合材料，通過(guò)3，3，5，5一四甲基聯(lián)苯胺（TMB）催化顯色，實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)CTC.但該方法靈敏度有限，且對(duì)樣品純度要求高，其捕獲效率還有待提高，總的來(lái)說(shuō)，以上檢測(cè)方法為CTC檢測(cè)開(kāi)拓了新思路.

3 CTC檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)及展望

目前，基于腫瘤細(xì)胞的物理電學(xué)特性進(jìn)行分離的技術(shù)缺乏特異性，因此聯(lián)合利用CTC的物理及生物特性，結(jié)合蛋白及核酸分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CTC的高效精準(zhǔn)捕獲及檢測(cè).

然而，CTC檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)也不容忽視.首先，CTC在復(fù)雜的血液背景下，含量極少.且CTC具有異質(zhì)性，沒(méi)有一種抗體能特異性100%靶向某種腫瘤細(xì)胞，只有約60%的CTC攜帶著生源實(shí)體腫瘤的生物信息.由于CellSearch僅適用于少數(shù)類(lèi)型的癌癥，且檢測(cè)靈敏度不高，無(wú)法分離活的CTC，因而較大程度地限制了其在臨床檢測(cè)中的有效應(yīng)用，為應(yīng)對(duì)該挑戰(zhàn)，有研究聯(lián)合使用多種抗體，對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原進(jìn)行表達(dá)分型，實(shí)現(xiàn)更高靈敏性檢測(cè)，或是尋找新的蛋白，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ plastin-danbai） [56].最后，抗體定向偶聯(lián)亦是CTC檢測(cè)面臨的一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)，抗體取向決定著抗原結(jié)合位點(diǎn)的活性，也就決定著材料或設(shè)備對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向能力[57-58]，抑或是用分子更小的特異性靶向多肽替換抗體，實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的檢測(cè)[29-30].此外，尋找具有腫瘤特異性的其他生物標(biāo)志物也是研究的熱點(diǎn).腫瘤來(lái)源外泌體相比于CTC，是具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，尺寸?。?0～150 nm），且量多.外泌體參與細(xì)胞通信、遷移，促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)[59].2016年，在液體活檢領(lǐng)域，基于一種新的生物標(biāo)志物，外泌體的腫瘤診斷產(chǎn)品首次在美國(guó)上市[60].因此，作為CTC的替代與補(bǔ)充，腫瘤來(lái)源的外泌體的檢測(cè)對(duì)于腫瘤早期預(yù)警具有很大的臨床應(yīng)用前景.

總的來(lái)說(shuō)，CTC檢測(cè)具有很大潛力，基于理論技術(shù)和深入探索，仍有望實(shí)現(xiàn)對(duì)CTC的高靈敏度、高特異性、高通量及高活性的分選，達(dá)到精準(zhǔn)檢測(cè).

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（責(zé)任編輯：郁慧，包震宇）

收稿日期：2019-12-12

基金項(xiàng)目：上海市地方院校能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（17070503000）

作者簡(jiǎn)介：蒲思思（1993-），女，碩士研究生，主要從事納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail：Pss_Anita@163.com

通信作者：賈能勤（1970-），男，教授，主要從事生物電化學(xué)、生物傳感器和納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail：nqjia@shnu.edu.cn

引用格式：蒲思思，周朝輝，賈能勤.循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離富集與分析檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，49（2）：219-233.