根結(jié)線蟲生防真菌交枝頂孢原生質(zhì)體的制備與再生體系構(gòu)建

姚玉榮 霍建飛 郝永娟

摘要 本研究以根結(jié)線蟲生防真菌交枝頂孢Acremonium implicatum為供試菌株，探究了菌齡、降解酶種類、酶解溫度和時間、不同滲透壓穩(wěn)定劑、不同pH等因素對其原生質(zhì)體制備的影響，并建立了交枝頂孢原生質(zhì)體制備體系;制備的原生質(zhì)體在SR培養(yǎng)基上再生率達(dá)到17.78%。此外，GFP遺傳轉(zhuǎn)化菌株的獲得充分表明制備的原生質(zhì)體可作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化材料，為進(jìn)一步研究交枝頂孢對根結(jié)線蟲的生防機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 交枝頂孢; 原生質(zhì)體制備; 再生; 綠色熒光蛋白

中圖分類號： S 435.45; S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019447

Abstract In order to establish protoplast-mediated genetic transformation of the biocontrol fungus Acremonium implicatum， the conditions for the isolation and regeneration of A.implicatum protoplasts were optimized， including culture time， enzyme system， enzymatic digestion time and temperature， type of osmotic stabilizers， pH value and so on. For the preparation of protoplasts， solid regeneration medium was better with a regeneration rate of protoplasts of 17.78%. The transformant strain with GFP was obtained. The system may build a foundation for further study on the mechanism of biocontrol against the root-knot nematode.

Key words Acremonium implicatum; protoplast preparation; regeneration; GFP

根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.是一類世界性分布的重要植物病原物，給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。蔬菜生產(chǎn)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的一部分，隨著保護(hù)地蔬菜種植面積的逐年增加，根結(jié)線蟲病害發(fā)生日益嚴(yán)重。根結(jié)線蟲種類繁多，分布廣，致病性強(qiáng)且寄主范圍廣泛、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，能侵染幾乎所有的蔬菜作物[1-2]。在蔬菜作物中，以茄科、十字花科和葫蘆科等受害最重[3]。蔬菜作物被根結(jié)線蟲侵染后會導(dǎo)致產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。根結(jié)線蟲還會與其他病原物形成復(fù)合侵染，造成更加嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。根結(jié)線蟲的防治主要為土壤熏蒸劑和化學(xué)殺蟲劑[4]，但是由于使用不規(guī)范、危害人類健康、污染環(huán)境等問題的頻繁出現(xiàn)，越來越多的化學(xué)農(nóng)藥被禁止使用[5-6]。尋找高效且環(huán)境友好的根結(jié)線蟲防治措施是當(dāng)前亟待解決的問題之一。因此應(yīng)用微生物防治根結(jié)線蟲已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)內(nèi)容。木霉Trichoderma spp.[7-8]、擬青霉Paecilomyces spp.[9]以及枝頂孢Acremonium spp.[10-11]等生防菌對根結(jié)線蟲的防治效果顯著。然而，對生防真菌防治線蟲機(jī)制的研究相對較少，限制了當(dāng)前生物防治方法的應(yīng)用。鑒于這種情況，需要加深對生防真菌防控機(jī)理的研究，而這項(xiàng)研究的關(guān)鍵技術(shù)就是建立生防菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。絲狀真菌高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建一般通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或者聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)[12-17]。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡單等特點(diǎn)，因此原生質(zhì)體的制備是遺傳轉(zhuǎn)化的首要問題。

近年來，許多學(xué)者對絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了大量的研究，但是由于真菌細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，制備原生質(zhì)體的體系和條件存在很大的差別。交枝頂孢A.implicatum對根結(jié)線蟲具有良好的生防作用[18-19]，考慮到其在線蟲防治中良好的應(yīng)用前景，對該菌進(jìn)行原生質(zhì)體制備與再生的研究，可為A.implicatum遺傳體系的建立以及該菌生防機(jī)理的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

交枝頂孢A.implicatum菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜病害室保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯湯汁培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，D-葡萄糖20 g，定容至1 L;PDB）用于菌株產(chǎn)孢。馬鈴薯固體培養(yǎng)基（馬鈴薯湯汁培養(yǎng)基，1.5%瓊脂;PDA）用于制備新鮮菌絲。固體再生培養(yǎng)基（0.1%酵母提取物，01%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖， 0.7%瓊脂粉;SR），液體再生培養(yǎng)基（0.1%酵母提取物，0.1%酶水解干酪素，1 mol/L蔗糖; LR）。

原生質(zhì)體制備所需試劑：PTC溶液（60%聚乙二醇3350，10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，50 mmol/L氯化鈣），STC溶液（1.2 mol/L山梨醇，50 mmol/L氯化鈣，10 mmol/L Tris-HCl）。

1.3 交枝頂孢原生質(zhì)體的制備

本試驗(yàn)采用酶解細(xì)胞壁法制備生防真菌交枝頂孢的原生質(zhì)體。設(shè)置菌絲培養(yǎng)時間、裂解酶系統(tǒng)、酶解時間和溫度、不同pH等試驗(yàn)參數(shù)，建立該菌株原生質(zhì)體制備和再生體系。

1.3.1 菌絲培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體制備的影響

參照Parsons等[20]的方法制備原生質(zhì)體并略有改動。交枝頂孢菌株在PDA平板上28℃黑暗培養(yǎng)5 d，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔，取一菌塊置于PDB中25℃，150 r/min 培養(yǎng)2 d，收集孢子并制備成均勻的孢子懸浮液（1×108個/mL）。取1 mL孢子懸浮液置于100 mL PDB中25℃， 150 r/min分別培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，用滅菌過濾網(wǎng)過濾，然后用滲透壓穩(wěn)定劑反復(fù)充分沖洗收集菌絲，待菌絲沖洗至團(tuán)狀后轉(zhuǎn)至滅菌的50 mL離心管中（離心管需提前稱重），整個操作過程在超凈工作臺進(jìn)行。用離心管稱取收集好的菌絲0.5 g，加入2 mL酶解液（20 mg/mL崩潰酶）后置于搖床上振蕩孵育，3 h后觀察原生質(zhì)體獲得率，選出最適宜制備交枝頂孢原生質(zhì)體的菌齡。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

為了檢測制備的原生質(zhì)體能否用于轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建好的含有GFP基因的表達(dá)載體pCH-sGFP（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供）通過聚乙二醇介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在藍(lán)色激發(fā)光下，觀察到轉(zhuǎn)化子發(fā)出明亮的綠色熒光（圖8），說明GFP基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入交枝頂孢A.implicatum中，且能夠正常表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

原生質(zhì)體的制備和再生是建立真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中的關(guān)鍵技術(shù)，直接影響遺傳轉(zhuǎn)化效率。本研究采用單因素試驗(yàn)研究了影響內(nèi)生真菌交枝頂孢原生質(zhì)體制備和再生的條件，明確了交枝頂孢原生質(zhì)體制備及再生的最適宜條件為：孢子液搖培36 h，用滅菌的過濾網(wǎng)過濾后，以pH為6.5的0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑反復(fù)洗滌菌絲，用濃度為20 mg/mL的崩潰酶按照0.5 g菌絲：2 mL酶液在28℃恒溫（120 r/min）酶解3 h，以SR培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。

研究發(fā)現(xiàn)制備原生質(zhì)體時菌絲的生理狀態(tài)對原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量有著重要的影響。通常在菌絲線性生長早期原生質(zhì)體容易制備，但也并不是菌絲越幼嫩越容易酶解。菌絲在其生長的某個階段對降解酶最為敏感，可能是由于菌絲不同生長階段細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成不同，使得其對降解酶的敏感性不同[24-25]。

不同種類真菌細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)不同，所用的裂解酶和酶解時間差異很大。弭寶彬等發(fā)現(xiàn)15 mg/mL崩潰酶對尖孢鐮刀菌辣椒?；虵usarium oxysporum f. sp. capsicum酶解效率最高[26]。趙小強(qiáng)等對制備大麗輪枝菌Verticillium dahliae原生質(zhì)體的條件進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，裂解酶濃度為10 mg/mL時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高[27]。因此，細(xì)胞壁降解酶是原生質(zhì)體制備的另一個關(guān)鍵因素。試驗(yàn)采用了兩種降解酶系統(tǒng)，試驗(yàn)結(jié)果表明對于交枝頂孢而言，20 mg/mL的崩潰酶酶解效果優(yōu)于纖維素酶和溶壁酶混合酶的酶解效果。

在交枝頂孢原生質(zhì)體制備的過程中，原生質(zhì)體的數(shù)量隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在3 h時達(dá)到峰值，可能的原因?yàn)槊附鈺r間長導(dǎo)致酶液活性降低或原生質(zhì)體破裂。時濤等在橡膠多主棒孢的原生質(zhì)體制備以及李伶俐等在甘藍(lán)枯萎病菌原生質(zhì)體制備研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[28-29]。

本研究建立了食線蟲真菌交枝頂孢原生質(zhì)體的制備和再生體系，同時探明了體系相關(guān)的影響因素，為進(jìn)一步研究交枝頂孢對根結(jié)線蟲的生防機(jī)理提供了重要的材料基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）