香龍血樹嵌合體離體再生培養(yǎng)體系研究

夏勝 蔡紅菊 施蘭

摘 要：為建立香龍血樹嵌合體組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以金邊香龍血樹和金心香龍血樹的葉片、莖段為外植體，研究愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)及繼代增殖培養(yǎng)情況。結(jié)果表明：2種材料葉片均未誘導(dǎo)出愈傷組織;金邊香龍血樹莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5g/L活性炭;金心香龍血樹莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基均為：MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊及金心香龍血樹正常愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹嵌合體愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化最佳培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹綠色不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹嵌合體不定芽和金心香龍血樹綠色不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭。

關(guān)鍵詞：香龍血樹;嵌合體;離體培養(yǎng)

中圖分類號 S687文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）22-0029-05

Abstract：Using the leaves and stems of as the explants，callus induction culture and the subculture proliferation culture were studied on Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. massangeana with a view to establishing a tissue culture rapid propagation system of Dracaena fragrans chimera. The results showed that the leaves of both materials were not able to induce callus. MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/ L2，4-D+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing the callus of the stem section of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for callus induction of the stem section of Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing adventitious bud differentiation of normal callus of Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for chimera callus of Dracaena fragrans cv. lindenii inducing differentiation of adventitious buds，MS+3.0mg/ L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for adventitious bud proliferation of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg /LNAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for the proliferation of adventitious buds of Dracaena fragrans cv. lindenii chimera and green adventitious buds of Dracaena fragrans cv. massangeana.

Key words：Dracaena fragrans;Chimera;In vitro culture

香龍血樹（Dracaena fragrans）是百合科龍血樹屬常綠喬木植物，別名也門鐵、大龍血樹、香千年木、巴西木、巴西鐵樹、山德氏龍血樹[1]，呈灌木或喬木狀，莖較粗，葉片寬大，叢生于莖頂，穗狀花序，花小，帶有濃烈的香氣，是良好的香味樹種，極具觀賞價(jià)值[2]。

香龍血樹被廣泛用作園林園藝中流行的觀葉植物，其主要繁殖方法包括扦插繁殖、高空壓條繁殖、種子繁殖，最快的繁殖方法是組織培養(yǎng)，利用該技術(shù)可以生產(chǎn)無毒的幼苗，獲得大規(guī)模育苗，有效地解決市場種苗短缺的問題。Vinterhalte最早采用組織培養(yǎng)技術(shù)成功誘導(dǎo)出香龍血樹的愈傷組織并培育成苗[2]。漆麗萍等[3]、何業(yè)華等[4]、陳興華等[5]、陳麗文等[6]采用MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加IAA、6-BA、KT、Ad、NAA、IBA等作為生長調(diào)節(jié)劑，以香龍血樹的莖段、腋芽、頂芽、葉片為接種材料，通過研究都已經(jīng)取得了成功。

嵌合體植株極具觀賞價(jià)值，嵌合體會使植株葉片出現(xiàn)2種或2種以上的不同顏色，主要是通過不同遺傳類型的植物組織細(xì)胞保留在頂端細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化成為分生組織后分化出葉原基而形成，能夠培育出多種稀奇的新品種植物[7]。嵌合體植物因其色彩絢麗、奇異新穎，已被很多國家廣泛研究和利用，在觀賞植物市場的開發(fā)和利用中發(fā)揮著重要作用。我國植物資源豐富，種類繁多，觀賞植物的開發(fā)和生產(chǎn)具有十分廣闊的前景，加強(qiáng)植物嵌合體的研究，促進(jìn)其開發(fā)利用，具有十分重大的意義和價(jià)值[8]。常見的香龍血樹嵌合體栽培品種有金邊香龍血樹、金心香龍血樹、黃邊香龍血樹、銀邊香龍血樹[9]。

雖然植物嵌合體極具觀賞價(jià)值，但由于植物嵌合體的結(jié)構(gòu)特征很不穩(wěn)定，嵌合體性狀難以保持，在組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常會發(fā)生變異[10]。何業(yè)華等[4]、易清等[11]、呂秀立等[12]通過組織培養(yǎng)對植物嵌合體性狀穩(wěn)定性、變異規(guī)律及調(diào)控進(jìn)行了研究。研究表明，在不定芽分化誘導(dǎo)和增殖過程中，選擇能抑制愈傷組織的形成和分化，以及促進(jìn)腋芽分化和萌發(fā)的技術(shù)措施，能增強(qiáng)組織培養(yǎng)過程中嵌合體性狀的穩(wěn)定性[4]。王燕等[10]通過定芽途徑即從頂芽誘導(dǎo)叢生芽增殖和從去除頂芽的莖段誘導(dǎo)腋芽增殖，結(jié)果顯示叢生芽增殖方式增殖率高于腋芽增殖率，但叢生芽增殖方式的變異率更高，因此認(rèn)為腋芽增殖繁殖是保持嵌合體特性的離體快繁的最佳方式。激素高低也會影響嵌合體性狀的穩(wěn)定性，激素濃度越高，嵌合體的變異率越低，選擇合適的激素濃度也可以保持嵌合體性狀的穩(wěn)定性[12]。

1 材料與方法

1.1 材料 金心香龍血樹的葉片和莖段材料，來源于普洱學(xué)院小山坡發(fā)現(xiàn)的金心香龍血樹植株;金邊香龍血樹的葉片和莖段材料，來源于喜慶園林責(zé)任有限公司取材進(jìn)行香龍血樹組織培養(yǎng)研究培育出的金邊香龍血樹變異植株[3];金邊及金心香龍血樹不定芽增殖和愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的材料，來源于前兩者外植體經(jīng)過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生。

1.2 方法

1.2.1 外植體預(yù)處理 分別截取金心香龍血樹和金邊香龍血樹的葉片和莖段，把葉片表面清洗干凈，然后將葉片帶有黃色條紋狀的部分剪成長3cm、寬2cm左右的方形，置于自來水下沖洗30min;洗凈莖段表面肉眼可見的臟物，重點(diǎn)清洗莖基部，然后置于自來水下沖洗30min。

1.2.2 外植體消毒與滅菌 葉片消毒滅菌：用酒精浸泡15s，然后在0.1%的升汞溶液下消毒滅菌9min，邊消毒邊震蕩，最后用滅菌過的蒸餾水沖洗4次。

莖段消毒滅菌：將金邊香龍血樹和金心香龍血樹的莖段，先用75%酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞溶液消毒滅菌9 min，最后用蒸餾水沖洗4次。

1.2.3 培養(yǎng)基的配方與外植體接種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA+NAA+2，4-D+IAA+0.5g/L活性炭，6-BA設(shè)置1、2、3、5mg/L 4個濃度，NAA設(shè)置0.1、0.2、0.5mg/L 3個濃度，2，4-D設(shè)置0.5mg/L 1個濃度，IAA設(shè)置0.2mg/L 1個濃度，7種培養(yǎng)基配方見表1。其中1～4號為初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基;5～7號為繼代增殖培養(yǎng)基。

葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)：將消毒9min的金邊和金心香龍血樹的葉片切成0.5cm×1.0cm大小，然后分別接種到1、2、3、4共4種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3個葉片，觀察4種培養(yǎng)基中葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果。

不定芽增殖和愈傷組織誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)：選取金邊及金心香龍血樹組織培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織和不定芽接種于5、6、7三種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種1個培養(yǎng)材料，觀察愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對香龍血樹葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果 金心香龍血樹和金邊香龍血樹的葉片在1、2、3、4號培養(yǎng)基上均沒有產(chǎn)生愈傷組織（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對香龍血樹莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果 由表3可知，金邊香龍血樹莖段愈傷組織在3號培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，為30%;其次是2號培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，為25%;1號和4號培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低，僅為10%。因此，金邊香龍血樹莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為3號培養(yǎng)基。金心香龍血樹莖段在2號培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，為40%;其次是3號和1號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率分別為30%和25%;4號培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低，僅為10%。因此，金心香龍血樹莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為2號培養(yǎng)基。誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中，誘導(dǎo)愈傷組織上開始分化出不定芽。

2.3 金邊及金心香龍血樹愈傷組織和不定芽繼代培養(yǎng) 通過莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了金邊和金心香龍血樹的愈傷組織和不定芽，其中發(fā)現(xiàn)金邊香龍血樹莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織中，有正常愈傷組織（圖1d）和嵌合愈傷組織（僅有1個，圖1e）之分;在正常愈傷組織中誘導(dǎo)出綠色不定芽（圖1a），在嵌合愈傷組織上誘導(dǎo)出嵌合不定芽（圖1b）。金心香龍血樹莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織均為正常愈傷組織（圖1f），分化出的均為綠色不定芽（圖1c）。

將已經(jīng)獲得金邊和進(jìn)行香龍血樹愈傷組織和不定芽材料進(jìn)行增殖，轉(zhuǎn)接至5～7號培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。由表4可以看出：金邊龍血樹正常愈傷組織在5號培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)形成芽最數(shù)最多為3.20±1.09;金邊香龍血樹嵌合體愈傷組織在7號培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)形成芽數(shù)最少為0.70±0.40;數(shù)據(jù)表明：5號培養(yǎng)基即MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭可以誘導(dǎo)愈傷組織獲得更多不定芽。

由表5可以看出：金邊龍血樹綠色不定芽在7號培養(yǎng)基中芽增殖倍數(shù)最高為4.60±1.18個;金邊龍血樹嵌合體不定芽在5號培養(yǎng)基中芽增殖倍數(shù)最高為2.60±0.65個。

圖2是在此次繼代實(shí)驗(yàn)中得到的金邊及金心香龍血樹綠色不定芽和嵌合體不定芽。如圖2a所示，是通過金邊不定芽增殖所得綠色不定芽，圖2b是由金邊嵌合不定芽增殖所得金邊葉色嵌合體不定芽，葉片邊緣為金黃色，保持了嵌合體性狀，圖2c是由金心不定芽增殖所得綠色不定芽（可能由于營養(yǎng)缺乏，已經(jīng)開始黃化），圖2d由金邊正常愈傷組織所得金邊正常綠色不定芽，圖2e由金邊嵌合體愈傷組織所得金邊葉色嵌合體不定芽，葉片邊緣為金黃色，保持了嵌合體性狀，圖2f是由金心正常愈傷組織所得正常綠色不定芽（可能由于營養(yǎng)缺乏，已經(jīng)開始黃化）。

經(jīng)過愈傷組織和不定芽繼代增殖后，有的金邊嵌合體愈傷后期死亡，有的嵌合愈傷分化出的不定芽仍為綠色，有的不定芽葉腋處分化的不定芽為綠色等原因，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，通過繼代增殖培養(yǎng)，獲得了22個保持金邊嵌合性狀的不定芽。

3 討論

耿開友等[13]認(rèn)為植物的金心或金邊是一種嵌合體的后生突變現(xiàn)象，其金黃色物質(zhì)僅存在于芽端生長點(diǎn)的細(xì)胞和莖的形成層之中，想要通過組織培養(yǎng)繁殖金邊虎尾蘭，必須以頂芽或側(cè)芽為外植體，利用叢生芽快繁途經(jīng)才能保持金邊性狀。因此，基于嵌合體特殊性考慮，應(yīng)首選用頂芽或側(cè)芽做為外植體。本研究的金邊香龍血樹材料來自組織培養(yǎng)中的變異株[3]，材料僅有一棵。金香龍血樹來源于普洱學(xué)院小山坡，僅有5株。劉和平等[14]用也門鐵（香龍血樹）葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了愈傷組織，最佳培養(yǎng)基配方是MS+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L NAA+1.0mg/L BA，誘導(dǎo)率達(dá)到44.4%。由于本研究的3號培養(yǎng)基和劉和平等[14]的最佳培養(yǎng)基配方一致，因此先以金邊和金心香龍血樹葉片作為外植體，但均未誘導(dǎo)出愈傷組織。而采用莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，2種材料均誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織。金心香龍血樹莖段產(chǎn)生的愈傷組織全部正常，金邊香龍血樹愈傷組織中僅有1個愈傷組織上分化出了嵌合體不定芽，可能是位于最靠近頂端分生組織的部位。

本研究通過初代培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)，獲得了22個保持金邊嵌合性狀的不定芽，為后續(xù)金邊嵌合性狀穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)。從本研究結(jié)果來看，莖段不適宜作為外植體開展組織培養(yǎng)研究來保持嵌合性狀。在嵌合體不定芽資源充足情況下，應(yīng)選用頂芽誘導(dǎo)叢生芽和莖段腋芽增殖途徑進(jìn)行增殖，在適宜培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，可對嵌合體進(jìn)行進(jìn)一步組培擴(kuò)繁研究。

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（責(zé)編：王慧晴）