程文，曾安貴，王毅，李攀，潘廣銳

1攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院·攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川攀枝花617067；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。雖然目前包括手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療和激素治療在內(nèi)的抗乳腺癌策略均取得了較大進(jìn)展，但乳腺癌患者預(yù)后并未明顯改善[2，3]。分子靶向治療是目前惡性腫瘤治療的熱點(diǎn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因是重要的抗腫瘤治療靶點(diǎn)，如表皮生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子受體等均已被證實(shí)為有效的治療靶點(diǎn)。因此在基因水平研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制對尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要[4]。p21激活激酶6(PAK6)屬于Ⅱ組PAK絲氨酸/蘇氨酸激酶的成員之一，在腦發(fā)育、調(diào)節(jié)體質(zhì)量、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PAK6與胃癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可參與腫瘤的藥物抵抗、增殖和轉(zhuǎn)移等惡性行為[6～8]。而PAK6與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前鮮見報(bào)道。2019年3～10月，本研究探討PAK6對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435S、MCF-7、MDA-MB-361購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM-F12、L-15和FBS購自美國BD公司；6孔板、96孔板和Transwell小室等購自美國Coring公司；PAK6 siRNA購自上海銳博生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；強(qiáng)效RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PVDF膜購自美國Promega公司；PAK6、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(pPI3K)、蛋白激酶B(pAKT)、GAPDH抗體購自英國abcam公司；CCK-8試劑盒購自北京東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞篩選 MCF-10A、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12，MDA-MB-435S、MDA-MB-361細(xì)胞培養(yǎng)基為L-15，血清濃度均為10%，細(xì)胞于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合90%左右時(shí)，按照1∶3傳代。經(jīng)qRT-PCR法檢測各細(xì)胞中PAK6 mRNA的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞中PAK6 mRNA相對表達(dá)量均高于MCF-10A，其中MCF-7中最高，因此以MCF-7作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集MCF-7細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，貼壁16 h，隨機(jī)分為si-NC組、si-PAK6組，按脂質(zhì)體2000說明書將NC siRNA(對照小干擾RNA)、抑制PAK6表達(dá)的小干擾RNA(PAK6 siRNA)與脂質(zhì)體2000混勻后分別加入si-NC組、si-PAK6組中，培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞內(nèi)PAK6 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。收集細(xì)胞，采用TRIzol裂解法提取細(xì)胞的總RNA。根據(jù)試劑盒說明書將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板。引物由上海捷瑞科技有限公司合成，PAK6上游引物5′-ACCAATAGGCATGGAATGAAGG-3′、下游引物5′- GCGGTCGGAAAGAGGAGT TG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′、下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。按PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，10× RT-PCR bufeer 1 μL、dNTP Mixture 0.4 μL、5× RT-PCR enhancer 2 μL、RNasin 0.1 μL、Hotmaster Taq polymerase 0.5 μL、Quant RTase 0.1 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、RNA模板1 μg，無RNA酶水補(bǔ)足10 μL，混勻離心后上機(jī)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：PCR初始變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 1 min，延伸65 ℃ 2 min，變性退火延伸進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，獲得各樣品的循環(huán)閾值(Ct)。用2-ΔΔCt法計(jì)算PAK6 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑10 μL，并各自設(shè)置空白對照組，孵育1 h后，檢測各組細(xì)胞在450 nm波長處的OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌去除血清和胰酶后計(jì)數(shù)，Transwell小室的上室加入1×105個(gè)細(xì)胞和100 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入500 μL含10%的FBS培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，終止培養(yǎng)，經(jīng)PBS洗滌、甲醇固定、結(jié)晶紫染色、干燥后顯微鏡(×100)下計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞內(nèi)pPI3K、pAKT蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，細(xì)胞完全裂解后，4 ℃下以14 000 r/min離心20 min，將上清液移至新的EP管中，檢測蛋白濃度并進(jìn)行煮沸變性，蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)，8%脫脂牛奶室溫孵育膜1 h，加入pPI3K、pAKT一抗稀釋液(1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入兔二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育2 h，采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。采用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 si-NC組、si-PAK6組PAK6 mRNA表達(dá)比較 si-NC組、si-PAK6組PAK6 mRNA相對表達(dá)量分別為1.06±0.12、0.45±0.08。與si-NC組比較，si-PAK6組PAK6 mRNA相對表達(dá)量低(P<0.05)。

2.2 PAK6低表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 si-NC組、si-PAK6組細(xì)胞增殖率分別為(100.00±0.00)%、(47.37±7.41)%。與si-NC組比較，si-PAK6組細(xì)胞增殖率低(P<0.05)。

2.3 PAK6低表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 si-NC組、si-PAK6組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(89.63±8.37)個(gè)、(28.58±5.21)個(gè)。與si-NC組比較，si-PAK6組穿膜細(xì)胞數(shù)少(P<0.05)。

2.4 PAK6低表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞內(nèi)pPI3K、pAKT蛋白表達(dá)的影響 pPI3K在si-NC組、si-PAK6組的相對表達(dá)量分別為1.42±0.20、0.75±0.11，pAKT相對表達(dá)量分別為1.59±0.18、0.81±0.14。與si-NC組比較，si-PAK6組pPI3K、pAKT蛋白相對表達(dá)量均低(P均<0.05)。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國乳腺癌發(fā)病率具有逐年增長的趨勢，到2021年乳腺癌患者將達(dá)到250萬例左右[9]。乳腺癌具有高度異質(zhì)性，包括多種類型。不同類型的乳腺癌有不同的治療方式，預(yù)后也存在明顯差異[10]。外科手術(shù)是早期乳腺癌的主要治療方法，但中晚期患者則多采用連續(xù)內(nèi)分泌治療、放化療等。內(nèi)分泌治療主要針對激素受體陽性的乳腺癌患者；而放化療因化學(xué)藥物的抵抗和放射敏感性差常導(dǎo)致療效欠佳，且放化療毒性反應(yīng)較大[11]。因此尋找新的有效治療途徑已經(jīng)成為乳腺癌治療的關(guān)鍵。分子靶向治療安全性高、不良反應(yīng)小、具有針對性，是腫瘤治療的主要研究方向。目前曲妥珠單克隆抗體和帕妥珠單克隆抗體等靶向藥物已應(yīng)用于臨床，但是未達(dá)到理想的療效[12]。腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移是乳腺癌惡性進(jìn)展的重要原因，也是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因[13]。因此研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找與乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的基因是開發(fā)藥物的突破點(diǎn)。

PAK6位于染色體15q15.1上，是編碼p21激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，主要表達(dá)于腦組織，定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞-細(xì)胞粘連中的神經(jīng)突上[14]。PAK6最初在前列腺癌活組織檢查和細(xì)胞系中作為雄激素受體的相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)，其在細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞凋亡和絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑等方面具有重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，PAK6是與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)的癌基因，在胃癌組織中PAK6表達(dá)升高，與患者耐藥相關(guān)，是腫瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[6]。抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PAK6的表達(dá)后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低，提示PAK6參與了非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移和侵襲，可作為治療非小細(xì)胞肺癌的潛在靶點(diǎn)[7]。Liu等[8]報(bào)道，雄激素刺激激活PAK6促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。本研究結(jié)果顯示，PAK6 mRNA在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，在抑制PAK6的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞增殖能力、遷移能力均明顯下降，說明PAK6在乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用。

PAK6通過結(jié)構(gòu)域與蛋白結(jié)合發(fā)揮作用[16]。Solanki等[17]報(bào)道，長期暴露于香煙煙霧的細(xì)胞中差異磷酸化的分子與PI3K/AKT/mTOR和CDC42-PAK信號通路相關(guān)，其中差異磷酸化的分子包括PAK6，提示PAK6可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。PAK家族中的另一成員PAK1通過調(diào)控ERK和AKT信號通路介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。PI3K/AKT信號通路是參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)遷移和血管生成的一條重要的信號途徑，在腫瘤中異常激活。AKT是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵分子，PI3K發(fā)生磷酸化促進(jìn)AKT的活化即磷酸化，磷酸化的AKT通過激活或抑制下游效應(yīng)分子，促進(jìn)細(xì)胞的生物學(xué)功能[19，20]。研究報(bào)道在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中PI3K/AKT信號通路發(fā)揮重要作用，pPI3K和pAKT在乳腺癌中均表達(dá)升高，抑制PI3K/AKT信號通路可抑制乳腺癌的惡性生物學(xué)行為[21]。本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞中干擾PAK6的表達(dá)可抑制pPI3K和pAKT蛋白的表達(dá)，提示干擾PAK6的表達(dá)可能通過抑制PI3K/AKT信號通路來影響乳腺癌的增殖和遷移。

綜上所述，PAK6低表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移，影響PI3K/AKT信號通路的激活是其可能的作用機(jī)制。PAK6可能是治療乳腺癌新的分子靶標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。