周星辰，閔敬亮，束漢生，王大巍，程哲，張輝，王昊，楊光

蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,安徽蚌埠 233000

人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)是一群具有自我更新、無限增殖、多向分化能力的腫瘤細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞表型CD133，常常集中存在于腫瘤壞死區(qū)周邊、微血管周圍以及腫瘤邊緣等膠質(zhì)瘤常發(fā)生侵襲播散的部位。GSCs向遠(yuǎn)處的侵襲播散，是惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)及無法根治的重要原因[1～3]。我們前期研究[4，5]發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路活化的GSCs侵襲遷移能力更強(qiáng)，Notch1信號(hào)通路活化后可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)調(diào)節(jié)GSCs的侵襲遷移。馬健會(huì)發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路能夠反向調(diào)控Notch1信號(hào)通路的表達(dá)?？梢姡琋otch通路與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路具有交互作用，抑制其中1條信號(hào)通路無法很好的起到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的作用；在急性淋巴細(xì)胞白血病中，單獨(dú)應(yīng)用Notch信號(hào)通路抑制劑可導(dǎo)致PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性增加，使腫瘤細(xì)胞對(duì)Notch信號(hào)通路抑制劑產(chǎn)生耐受，單獨(dú)應(yīng)用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑也會(huì)引起Notch信號(hào)通路活化，使腫瘤細(xì)胞對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑產(chǎn)生耐受[6]。聯(lián)合應(yīng)用Notch1信號(hào)通路及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑或許能夠減少GSCs的侵襲遷移能力，達(dá)到更好的治療效果，為膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。2020年1～2月，我們觀察了聯(lián)合應(yīng)用Notch1信號(hào)通路抑制劑(DAPT)和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑(PI-103)對(duì)GSCs侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。DAPT和PI-103,DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基,B27,表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),CD133、nestin、Hes1抗體,pmTOR(Ser2448)抗體,小鼠抗人GAPDH抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊二抗。Transwell小室,Matrigel基質(zhì)膠。

1.2 GSCs的獲取及鑒定 取U87細(xì)胞置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)以及B-27(1∶50)配置。待形成懸浮生長的干細(xì)胞球后，使用1.25 g/L胰蛋白酶和2 mmol/L的乙二胺四乙酸常規(guī)消化、漂洗細(xì)胞。利用CD133免疫磁珠細(xì)胞分離試劑盒分離細(xì)胞，將收集的CD133+和CD133-的細(xì)胞重懸置于無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為室溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2。取培養(yǎng)獲得的第3代細(xì)胞球，免疫熒光染色后免疫熒光激光共聚焦顯微鏡下觀察到，獲得細(xì)胞球中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133與nestin陽性表達(dá)，說明GSCs分選成功。

1.3 GSCs分組、DAPT和PI-103處理方法 取GSCs細(xì)胞，分為DAPT處理組(A組)、PI-103處理組(B組)、DAPT和PI-103 共同處理組(C組)、藥物溶媒對(duì)照組(D組),A組加入20 μmol/L的DAPT培養(yǎng)，B組加入4 μmol/L的PI-103培養(yǎng)，C組加入20 μmol/L的DAPT+4 μmol/L的PI-103共培養(yǎng)，對(duì)照組不作任何處理。

1.4 各組細(xì)胞Notch1活化標(biāo)志物(HES1、pmTOR蛋白)檢測(cè) 采用Western blotting法。在干細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)各組細(xì)胞,成熟后收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，-80 ℃保存。取各處理組的總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴下以80V電壓轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜(PVDF膜)，時(shí)間為90 min。PBST緩沖液洗膜3次，脫脂奶粉封閉2 h。剪膜后加入不同一抗后4 ℃孵育過夜，兔抗人Notch1抗體、兔抗人HES1抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人pAkt抗體、兔抗人mTOR抗體以及兔抗人pmTOR抗體的稀釋比例均為1∶1 000。次日復(fù)溫清洗后加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。使用凝膠成像分析系統(tǒng)采集條帶結(jié)果，使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化分析，分析特異性條帶的光密度值，作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力觀察 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室加在24孔板上，取60 μL matrigel膠均勻鋪在小室上室，37 ℃溫箱內(nèi)預(yù)置60 min。上室每孔加100 μL約含有2×104個(gè)細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液，下室中加500 μL的10%胎牛血清的DMEM。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將小室取出，棄掉上室內(nèi)的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定5 min，結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，100倍倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算穿過膜的細(xì)胞數(shù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)不鋪matrigel膠，其余同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。均重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組Hes1、pmTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C、D組Hes1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.77±0.07、0.41±0.04、0.40±0.03、0.78±0.06，pmTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.02、0.33±0.02、0.19±0.01、0.62±0.05;與D組和A處理組相比，B、C組Hes1的蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.01)；與D組相比，A、B、C組pmTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)；與A、B組比較，C組pmTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。

2.2 各組侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)比較 A、B、C、D組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)分別22.35±6.75、26.87±6.91、8.21±3.53、61.63±10.87，A、B、C、D組遷移穿膜細(xì)胞數(shù)分別為23.18±6.56、25.09±6.73、8.78±3.67、63.25±11.03;與D組相比，A、B、C組侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)降低(P均<0.05)；與A、B組比較，C組侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)降低(P均<0.05)。

3 討論

Notch信號(hào)通路在人腦腫瘤中處于異常激活狀態(tài)，起著維持GSCs的自我更新、促進(jìn)其增殖、抑制其分化的作用[7，8]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和GSCs中亦處于高度激活狀態(tài)，是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的重要信號(hào)通路[9，10]。前期我們通過對(duì)Notch1信號(hào)通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別升高，Notch1活化標(biāo)志物Hes1表達(dá)也隨之升高；在GSCs中Notch1信號(hào)通路處于高度活化狀態(tài)，且使用DAPT抑制Notch1通路活性后，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活性降低，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲遷移能力下降[4，5]，表明Notch1通路經(jīng)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)解膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲遷移。但Notch通路與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路具有交互作用，單一的抑制其中一條信號(hào)通路無法很好的起到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的作用；因此，聯(lián)合應(yīng)用兩種通路抑制劑或許能夠達(dá)到降低GSCs侵襲遷移能力的目的，取得更好的治療效果，為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫磁珠分選法在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離出CD133+表達(dá)的細(xì)胞，在體外對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，成功獲得可連續(xù)傳代的GSCs。本研究將GSCs分為4組， DAPT為γ分泌酶抑制劑，能夠有效的抑制Notch1信號(hào)通路的活化，為Notch1通路特異性抑制劑[11,12]，PI-103為P13K/mTOR雙靶點(diǎn)小分子抑制劑，可以特異性抑制P13K 和mTOR活性，且不會(huì)因信號(hào)反饋而使Akt激活，其抑制效果明顯優(yōu)于其它抑制劑[13，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，A組Hes1相對(duì)表達(dá)量明顯降低，表明Notch1信號(hào)通路得到有效的抑制;B組的pmTOR相對(duì)表達(dá)量明顯降低，表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路得到有效的抑制;C組Hes1和pmTOR蛋白表達(dá)明顯降低，表明Notch1信號(hào)通路和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路均得到有效的抑制；C組pmTOR蛋白表達(dá)明顯低于A、B組，結(jié)合我們前期研究Notch1信號(hào)通路經(jīng)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)GSCs的侵襲遷移能力，推測(cè)通過聯(lián)合抑制Notch1信號(hào)通路和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可以進(jìn)一步降低GSCs的侵襲遷移能力。本研究還發(fā)現(xiàn),與D組相比，A、B、C組的遷移和侵襲能力下降，表明通過分別抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、Notch1信號(hào)通路、聯(lián)合抑制Notch1信號(hào)通路和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路均可以使GSCs的侵襲、遷移能力降低；其中A、B組穿過小室聚碳酸酯膜的平均每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)目明顯高于C組，表明通過聯(lián)合抑制Notch1信號(hào)通路和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路使GSCs的侵襲遷移能力進(jìn)一步下降。

總之，聯(lián)合抑制Notch1信號(hào)通路和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路能夠顯著降低GSCs侵襲、遷移能力。