任秀梅，張楠，邢金云，吳雙

1南通大學附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通市中醫(yī)院

膝關節(jié)骨關節(jié)炎(KOA)是一種以關節(jié)軟骨退化損傷、骨質增生為主要病變特點的退行性疾病，其病理改變以關節(jié)軟骨變性和丟失為主。艾灸作為我國傳統(tǒng)自然療法，治療KOA的臨床療效顯著，且操作簡便、安全，無藥物、手術等治療的不良反應或并發(fā)癥。薈萃分析顯示，艾灸能有效減輕KOA患者關節(jié)疼痛，緩解關節(jié)功能限制[1，2]。本課題組前期開展的艾灸治療KOA的隨機對照臨床試驗結果顯示，艾灸可以緩解患者的疼痛、關節(jié)僵硬等臨床癥狀，并短期內提高患者的生活質量[3，4]。一般認為，艾灸的治療機制主要與熱效應、輻射效應等有關，但其作用的具體分子機制尚不明確。近年研究結果表明，Caveolin-1/p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路激活在KOA的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5～7]。2017年12月～2019年2月，我們觀察了艾灸對兔KOA關節(jié)軟骨組織內Caveolin-1/p38 MAPK通路蛋白表達的影響，以探討艾灸治療KOA的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑 健康新西蘭大耳白兔40只，體質量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由南通大學實驗動物中心提供(合格證號：201829201)；實驗過程遵循實驗倫理學要求，盡量減少動物使用量，并最低限度減少動物的痛苦。艾條由泰州市灸療研究所提供；木瓜蛋白酶(Worthington，USA)，p38阻斷劑SB203580(APExBIO，Houston，USA)，兔抗Caveolin-1(Abcom，ab2910)、p38 MAPK(Abclonal，A5521)、p-p38 MAPK-T180/Y182一抗(Abclonal，AP0526)，小鼠抗β-actin抗體(Abclonal，AC004)、山羊抗兔通用型二抗(北京中杉公司，ZB-2301)。

1.2 動物分組與KOA模型建立 將兔按隨機數字表法分為對照組、模型組、艾灸組、抑制劑組，每組各10只。除對照組外，其余三組采用關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶的方法建立KOA模型。稱取木瓜蛋白酶40 mg溶于1 mL生理鹽水中，制備4%木瓜蛋白酶溶液，充分混勻后靜置30 min；以0.22 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。造模方法：自兔外膝眼處，于右后肢膝關節(jié)腔內注射4%木瓜蛋白酶0.1 mL/kg，第1、3、5天每日注射1次，注射結束后繼續(xù)歸籠喂養(yǎng)，造模期間每日驅趕兔活動30 min，2周后獲得KOA模型。

1.3 干預處理 造模成功后，艾灸組將兔固定于固定器中；于右側膝關節(jié)內、外側局部剪毛，參照《實驗針灸學》定位兔犢鼻穴、足三里穴；點燃艾條施灸，艾條燃端距離穴位處皮膚2 cm，施灸過程中觀察兔的反應；每次每穴15 min，每周5次，連續(xù)治療3周。抑制劑組關節(jié)腔內注射p38 MAPK抑制劑SB203580 0.1 mL(100 μmol/L)，每周1次，連續(xù)3周。模型組、對照組均不予治療，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，每日固定器固定30 min。

1.4 軟骨組織中Caveolin-1/p38 MAPK通路蛋白檢測 采用Western blotting法。治療結束后，耳緣靜脈注射空氣處死各組動物。在無菌條件下，分離脛骨平臺內側關節(jié)面的完整軟骨及軟骨下骨組織，剪成碎塊。加入RIPA強蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)，放置冰上裂解30 min；超聲勻漿，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min；提取上清液，分裝于EP管中，-80 ℃保存。BCA法蛋白定量后行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉2 h；TBST洗膜，分別加入一抗Caveolin-1(1∶500)和p38 MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)，4 ℃震蕩孵育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)后，室溫孵育1 h；洗滌后ECL發(fā)光液顯影，用Image J圖像分析軟件檢測目的條帶校正后的灰度值，以目的條帶與內參的灰度比值表示其相對表達量，以p-p38 MAPK/p38 MAPK表示p38 MAPK蛋白活化情況。

2 結果

2.1 各組軟骨組織中Caveolin-1蛋白表達比較 模型組、艾灸組、抑制劑組軟骨組織中Caveolin-1蛋白分別為2.09±0.07，1.45±0.05，1.09±0.07，均高于對照組的1.00±0.11(P均<0.05)；與模型組比較，艾灸組、抑制劑組Caveolin-1蛋白表達降低(P均<0.05)；與抑制劑組比較，艾灸組Caveolin-1蛋白表達增加(P<0.05)。

2.2 各組軟骨組織中p38 MAPK蛋白活性比較 模型組、艾灸組、抑制劑組p38 MAPK蛋白活性分別為3.25±0.08、2.52±0.17、2.07±0.14，均高于對照組的1.00±0.05(P均<0.05)；與模型組比較，艾灸組、抑制劑組軟骨組織中p38 MAPK蛋白活性降低(P均<0.05)；與抑制劑組相比，艾灸組p38 MAPK蛋白活性增加(P<0.05)。

3 討論

KOA是老年人常見的慢性關節(jié)疾患，其病理學特征是關節(jié)軟骨面毛糙、脫落使軟骨層變薄甚至消失。然而，迄今為止骨關節(jié)炎軟骨破壞的確切機制尚不十分清楚。本課題組的前期研究結果顯示，艾灸可降低患者血清IL-1β、COX-2、COMP水平[8]，但艾灸治療KOA的分子機制仍不明確。

Caveolin-1是細胞膜凹陷結構的主要結構分子，廣泛分布于終末分化的細胞，如脂肪細胞、內皮細胞、肌細胞等。它是許多信號分子的支架蛋白和負性調節(jié)蛋白，介導細胞內化、合成、增殖、遷移、凋亡等多種信號的轉導，是細胞信號轉導中心。有研究顯示，骨關節(jié)炎患者及骨關節(jié)炎大鼠的關節(jié)軟骨細胞中Caveolin-1蛋白表達顯著增加，且Caveolin-1蛋白表達水平與軟骨損害程度相關[9～11]。本研究結果也發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組關節(jié)軟骨組織中Caveolin-1蛋白表達增加，與上述文獻報道結果一致；與模型組比較，艾灸組與抑制劑組關節(jié)軟骨組織中Caveolin-1蛋白表達均有所下降，雖然抑制劑組下降大于艾灸組，但結果仍能提示艾灸的治療作用可能與降低Caveolin-1蛋白表達相關。

Caveolin-1蛋白對軟骨細胞內p38 MAPK信號通路的激活具有重要作用，是p38 MAPK上游的關鍵信號分子[9]。Caveolin-1蛋白高表達能誘導p38 MAPK信號通路激活，并導致軟骨細胞合成Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的能力減弱，從而促進軟骨細胞凋亡。研究表明，p38 MAPK可調控軟骨細胞增殖、生存，維持細胞外基質代謝平衡，在基質金屬蛋白酶(MMP)、促炎癥因子等所致骨關節(jié)炎軟骨退變病理進程中具有關鍵作用[12]。因此，p38 MAPK信號通路有可能作為骨關節(jié)炎的治療靶點。p38 MAPK磷酸化位點是決定激酶活性的關鍵結構，只有在蘇氨酸(T180)和酪氨酸(Yl82)雙位點同時被磷酸化時才具有全部活性，并在控制其自主磷酸化上起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，關節(jié)腔內注射p38 MAPK抑制劑SB203580，能顯著降低MMP-1/13表達[13]，有效抑制其軟骨細胞凋亡，減緩關節(jié)軟骨的退變[14]。針灸治療也能夠降低兔KOA關節(jié)軟骨組織中MMP-1/13表達[15]，抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子釋放[16]，從而延緩膝關節(jié)軟骨的進一步破壞，達到治療KOA的目的。本研究結果顯示，模型組Caveolin-1蛋白表達和p38 MAPK蛋白活性均較對照組增加，艾灸組和抑制劑組Caveolin-1蛋白表達和p38 MAPK蛋白活性較模型組均下調，說明艾灸可能通過抑制Caveolin-1/p38 MAPK通路激活從而對KOA發(fā)揮治療作用。但是，從艾灸組與抑制劑組組間比較來看，艾灸治療兔KOA過程中除Caveolin-1/p38 MAPK通路參與外，可能還有其他分子通路的參與。

綜上所述，Caveolin-1/p38 MAPK信號通路激活在兔KOA關節(jié)軟骨退變破壞過程中起重要作用；艾灸可能通過抑制Caveolin-1/p38 MAPK信號通路異常激活，減少炎癥因子的釋放，進而延緩KOA的進展。