祖超，李蓉蓉，李志剛，王燦，魚歡，鄭維全，楊建峰

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所， 海南 萬寧 571533； 2.農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 萬寧 571533；3.海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 萬寧 571533)

香辛料之王胡椒，種子繁殖非生產(chǎn)期較長，生產(chǎn)中一般采用扦插繁殖，插條苗培育1個月后即可開花結(jié)果，導(dǎo)致胡椒整個生命周期都在開花結(jié)果。嚴(yán)格來說胡椒營養(yǎng)生長與生殖生長時期界限不明顯，造成了胡椒生殖生長和營養(yǎng)生長爭奪養(yǎng)分，在非主花期抽穗開花浪費(fèi)樹體養(yǎng)分。不僅胡椒，咖啡、龍眼、芒果等熱帶植物都存在周年開花結(jié)果現(xiàn)象，因此，探明調(diào)控胡椒花穗抽生脫落的關(guān)鍵生理過程，減少非主花期花量，增加主花期花量，對胡椒產(chǎn)業(yè)乃至整個熱作產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量生理學(xué)過程的研究具有重要意義。胡椒原產(chǎn)于印度西高止山脈熱帶雨林區(qū)，是多年生常綠耐蔭藤本植物[1]，根據(jù)耐蔭特性，以及光合產(chǎn)物和植物激素是調(diào)控花量的重要內(nèi)部信號[2-3]，前人研究多集中于改變光強(qiáng)調(diào)控葉片光合產(chǎn)物和激素含量，進(jìn)而增加或降低胡椒花穗數(shù)目，研究發(fā)現(xiàn)改變胡椒生長環(huán)境的光強(qiáng)，可以通過調(diào)控光合產(chǎn)物含量進(jìn)而影響胡椒花穗數(shù)目[4]、產(chǎn)量和品質(zhì)[1]，通過間作遮蔭可以提升葉片光合作用能力，這對產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率達(dá)52%[5]；光強(qiáng)還可以改變?nèi)~片內(nèi)源赤霉素含量影響胡椒花穗數(shù)目[6]，除了赤霉素，脫落酸也會影響植物成花，重度遮蔭也可以降低ABA/IAA和ABA/GA3不利于郁金香成花[7]。前期研究主要集中于光強(qiáng)可以改變?nèi)~片光合產(chǎn)物含量和激素含量調(diào)控胡椒花穗數(shù)目和產(chǎn)量，但是，光強(qiáng)過高或過低時，胡椒源葉應(yīng)答光脅迫的關(guān)鍵光合作用參數(shù)和激素指標(biāo)尚不清楚。本研究在已有研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探明光強(qiáng)調(diào)控源葉光合作用和激素含量對胡椒花穗抽生、脫落、成穗影響的關(guān)鍵生理過程，這對補(bǔ)充熱帶作物產(chǎn)量生理學(xué)過程研究，以及在生產(chǎn)中采用植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控花量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試材一：以在沙床培養(yǎng)1個月，長勢一致的胡椒插條苗為試材。

試材二：以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的胡椒試驗(yàn)示范基地 (18°1′N，110°13′E)內(nèi)的2齡熱引1號(PipernigrumL.cv.Reyin No.1)幼齡胡椒為試材。其中葉片形態(tài)、光合生理、碳代謝相關(guān)參數(shù)選取花所在葉位下一葉位的完全穩(wěn)定葉，即倒二葉為試材[1]。該區(qū)域年均溫24.6 ℃左右，日照時數(shù)1 804～2 300 h，年均降水量約2 164 mm。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)方法 試驗(yàn)選用福建九圃生物科技有限公司提供的智能補(bǔ)光系統(tǒng)(JIUPO-1WSLED-210)，設(shè)置405 μmol·m-2·s-1和270 μmol·m-2·s-12個試驗(yàn)處理，8個生物學(xué)重復(fù)，光照時間為12 h/12 h，晝夜溫度為28 ℃，插條苗采用石英砂栽培，澆灌營養(yǎng)液的方法，營養(yǎng)液組成(μmol·L-1)：75 K2SO4、65 MgSO4·7H2O、10 KCl、25 KH2PO4、1 MnSO4·H2O、1 ZnSO4·7H2O、1 CuSO4·5H2O、5(NH4)6MO7O24·4H2O、1 H3BO3、100 FeSO4·7H2O、100 Na2-EDTA、2 000 Ca(NO3)2·4H2O，培養(yǎng)時間為70 d。

1.2.2 田間原位遮蔭試驗(yàn)方法 此研究在2017年8月—2019年7月進(jìn)行，試驗(yàn)于8月上旬開始，設(shè)置全光照和遮蔭2個處理，主花期(9—11月)，全光照處理日均光合有效輻射(9:00—16:30)為322 μmol·m-2·s-1，日均最大光合有效輻射為1 110 μmol· m-2·s-1，遮蔭處理選用遮陽網(wǎng)遮蔭，日均光合有效輻射為137 μmol· m-2·s-1，日均最大光合有效輻射為335 μmol·m-2·s-1。每個處理選取 3 株長勢基本一致的植株，每株作為1個重復(fù)。種植園胡椒株行距為 2 m×2.5 m，植株高約1.5 m，冠幅約1.4 m，東西走向。

1.2.3 花穗數(shù)目測定 田間原位試驗(yàn)，每個處理選取3株長勢一致的胡椒，在主花期統(tǒng)計花穗數(shù)目，在果熟期統(tǒng)計果穗數(shù)目，差值即為脫落數(shù)，室內(nèi)采用掛牌方法統(tǒng)計花穗抽生、脫落數(shù)目。

1.2.4 光合參數(shù)測定 在花穗抽生長至穩(wěn)定后用LI6400型便攜式光合儀(LI-6400,LI-COR,Lincoln,NE,USA)測定胡椒花穗所在葉位下一葉位完全展開葉 9:00—11:30 時的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)。

1.2.5 胡椒源葉激素含量測定 本試驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)測定生長素(IAA)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)。3種激素的提取方法：稱取約0.1 g新鮮植物葉片，放入研缽中磨碎，加入1 mL預(yù)冷的甲醇，4 ℃浸取過夜。8 000 g離心10 min，殘渣用0.5 mL 60%甲醇浸取2 h，離心后取上清液，合并2次上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈芍敛缓袡C(jī)相，加入0.5 mL 10%石油醚萃取脫色3次，棄去上層醚相，下層40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?5%乙酸乙酯定容至0.5 mL，取適量溶液用針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)待測[8]。色譜檢測步驟及條件：開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，保留時間60 min，檢測波長254 nm，設(shè)置完畢保存方法組；用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 文中每個數(shù)據(jù)點(diǎn)來自3個重復(fù)的平均值，采用SPSS Statistic 25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。通過數(shù)據(jù)分析檢測不同光強(qiáng)處理對胡椒葉片光合作用、激素含量和花穗數(shù)目的影響是否存在顯著差異。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 光強(qiáng)對胡椒源葉光合作用的影響

室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)研究光強(qiáng)對胡椒源葉光合作用的影響。發(fā)現(xiàn)在花穗穩(wěn)定后測量葉片光合作用，發(fā)現(xiàn)270 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)處理下，光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)都顯著高于405 μmol·m-2·s-1，分別比405 μmol·m-2·s-1處理增加了60%、100%和54%。田間原位遮蔭試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理處理下，胡椒源葉光合參數(shù)都高于全光照處理，但是均不顯著。室內(nèi)和田間原位試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)降低光強(qiáng)的處理反而會提升胡椒葉片光合作用(表1)。

表1 光強(qiáng)對胡椒源葉光合作用的影響

2.2 光強(qiáng)對胡椒源葉激素含量的影響

2.2.1 室內(nèi)光強(qiáng)模擬對胡椒源葉激素含量影響 通過室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)研究光強(qiáng)對胡椒穩(wěn)定葉片內(nèi)源激素含量的影響，發(fā)現(xiàn)低光強(qiáng)270 μmol·m-2·s-1處理相對于光強(qiáng)高405 μmol·m-2·s-1處理，提升了源葉生長素(IAA)和脫落酸(ABA)含量，降低了赤霉素(GA3)含量，其中對GA3含量影響較大，但是差異都不顯著。而后又分析了源葉赤霉素與脫落酸相對含量(GA3/ABA)，發(fā)現(xiàn)低光強(qiáng)270 μmol·m-2·s-1處理相對于光強(qiáng)高405 μmol·m-2·s-1處理顯著降低了該比值20%；分析源葉生長素與脫落酸相對含量(IAA/ABA)，發(fā)現(xiàn)兩種光強(qiáng)處理對該比值沒有顯著影響(表2)。

2.2.2 田間原位遮蔭對胡椒源葉激素含量影響 通過田間原位遮蔭試驗(yàn)，研究光強(qiáng)對胡椒花穗發(fā)育不同階段相應(yīng)源葉激素含量的影響，發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)改變可以調(diào)控源葉激素含量，低光照可以降低源葉IAA含量，其中，在花穗發(fā)育到8 cm時，源葉IAA含量顯著降低53%(圖1-A)；隨著花穗的增長，源葉GA3含量是不斷增加的，遮蔭處理相對于全光照處理增加較多，但是差異不顯著(圖1-B)，光強(qiáng)改變對花穗發(fā)育到2 mm和4 cm時相應(yīng)葉片的ABA含量沒有顯著影響，遮蔭處理顯著降低了8 cm花穗相應(yīng)葉片ABA含量13%(圖1-C)。隨著花穗從2 mm長至8 cm，源葉GA3/ABA的值是不斷增加的，遮蔭和全光照無顯著差異，在4 cm和8 cm階段稍高于全光照(圖1-D)?；ㄋ氚l(fā)育不同階段，遮蔭處理下源葉IAA/ABA的值都低于全光照處理，其中花穗長至8 cm時差異達(dá)顯著含量，遮蔭處理比全光照低56%(圖1-E)。

2.3 光強(qiáng)對胡椒花穗數(shù)目的影響

室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)改變對胡椒抽穗數(shù)沒有顯著影響，但是會影響胡椒花穗脫落數(shù)，較低光強(qiáng)處理270 μmol·m-2·s-1相對于較高光強(qiáng)405 μmol·m-2·s-1處理顯著增加了花穗脫落數(shù)，最終導(dǎo)致成穗數(shù)目顯著降低了59%(圖2-A)；田間原位遮蔭試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)遮蔭會顯著降低胡椒抽穗數(shù)目，相對于全光照降低了40%，遮蔭增加了胡椒花穗脫落數(shù)，但是不顯著，最終胡椒成穗數(shù)目顯著降低36%(圖2-B)。

表2 室內(nèi)光強(qiáng)模擬對胡椒源葉赤霉素含量的影響

注：柱狀圖上方“(+)”代表不同處理間差異顯著(P=0.05)，n.s.代表不同處理間無顯著差異。下同。

3 結(jié)論與討論

光強(qiáng)過高導(dǎo)致胡椒光合速率降低[9]，光強(qiáng)過低導(dǎo)致胡椒花量減少[10]，而且不適宜光強(qiáng)還會導(dǎo)致胡椒生理過程紊亂[11]，因此，探明胡椒對不適宜光強(qiáng)做出的適應(yīng)性反應(yīng)，對調(diào)控胡椒生理過程，進(jìn)而增加胡椒花量、提高產(chǎn)量具有重要意義。本文采用研究不同光強(qiáng)對胡椒源葉光合作用和激素含量的影響，探明了響應(yīng)光強(qiáng)脅迫、調(diào)控胡椒成穗的關(guān)鍵源葉光合作用參數(shù)和激素指標(biāo)。

室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)和田間原位遮蔭試驗(yàn)的研究結(jié)果，都表明高光強(qiáng)會降低葉片光合作用能力，光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率在較高光強(qiáng)條件下降低，其中室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)處理間差異顯著。這些參數(shù)中，氣孔導(dǎo)度降低最多，可能是胡椒響應(yīng)光脅迫的關(guān)鍵光合作用參數(shù)。氣孔導(dǎo)度的改變可能是植物遇到脅迫時的一種反應(yīng)，ABA信號途徑在植物脅迫應(yīng)答中起核心作用[12]，增加植物體內(nèi)ABA含量會導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度降低[13]。本研究測定了植物葉片內(nèi)源ABA含量，發(fā)現(xiàn)田間遮蔭試驗(yàn)，較高光強(qiáng)處理下胡椒花穗發(fā)育至8 cm時，相應(yīng)穩(wěn)定葉片ABA含量相對于低光強(qiáng)處理顯著增加，可能與田間原位試驗(yàn)有高光強(qiáng)脅迫相關(guān)。田間全光照處理光合有效輻射值在中午較大，最終可以達(dá)到1 110 μmol·m-2·s-1，超過了胡椒的光飽和范圍450 ～900 μmol·m-2·s-1[1]，導(dǎo)致胡椒通過增加源葉ABA含量應(yīng)答高光強(qiáng)脅迫，ABA與受體結(jié)合，抑制PP2C磷酸酶活性[14]，進(jìn)而使SnRK2s 從PP2C-SnRK2的復(fù)合物中釋放出來，激活的SnRK2s 能夠磷酸化并激活下游的ABF等轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游的ABA應(yīng)答基因，從而激活A(yù)BA信號[15-17]，降低氣孔導(dǎo)度。田間原位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的光強(qiáng)增加導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度降低、ABA含量增加，這種抗逆反應(yīng)可能是促使胡椒成穗增加的關(guān)鍵因素之一。從田間試驗(yàn)光強(qiáng)對花穗數(shù)目的調(diào)控來看，光強(qiáng)調(diào)控的主要是花穗的抽生數(shù)目，但是，田間原位試驗(yàn)中，全光照處理下，胡椒2 mm花穗對應(yīng)葉片中ABA沒有顯著增加，一方面可能是ABA向庫器官轉(zhuǎn)運(yùn)了，另一方面可能是GA3的拮抗作用導(dǎo)致的[12]。

圖2 光強(qiáng)對胡椒花穗數(shù)目的影響

光強(qiáng)和激素信號途徑存在交叉互作影響[18-19]，GA3是光合作用的調(diào)節(jié)劑[3]，IAA對光合作用有促進(jìn)作用，所以本文又研究了內(nèi)源IAA和GA3對光強(qiáng)的響應(yīng)。室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同光強(qiáng)對源葉IAA和GA3含量沒有顯著影響，田間原位試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)花穗發(fā)育不同階段全光照處理源葉IAA含量要高于遮蔭處理，其中8 cm花穗對應(yīng)葉片IAA含量差異達(dá)顯著含量，葉片GA3含量，隨著花穗發(fā)育，2種光強(qiáng)處理下源葉GA3含量都是不斷增加的，其中遮蔭處理增加較多，但是與全光照無顯著差異。那么，室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)2種光強(qiáng)處理下抽穗數(shù)無顯著差異，但是，較低光強(qiáng)處理會導(dǎo)致花穗脫落顯著增加，最終成穗數(shù)較低光強(qiáng)顯著小于較高光強(qiáng)；田間原位試驗(yàn)2種光強(qiáng)處理下抽穗數(shù)達(dá)顯著含量，脫落數(shù)無顯著差異，較低光強(qiáng)抽穗數(shù)減少是導(dǎo)致成穗減少的關(guān)鍵。源葉激素含量在花穗抽生和脫落中起到一定作用，本研究發(fā)現(xiàn)室內(nèi)光強(qiáng)模擬試驗(yàn)，較低光強(qiáng)處理顯著降低了成熟源葉的GA3/ABA，這可能是導(dǎo)致其花穗脫落的關(guān)鍵因子，因?yàn)镚A3含量的提升有利于胡椒花穗數(shù)目增加[6]，這與擬南芥的研究結(jié)果相似[20]，但是與郁金香[7]、芒果[21]和百合[22]研究結(jié)果不同，這可能是因?yàn)楹窞槎倘照罩参?，在短日照植物中，因?yàn)槿狈庵芷陂_花途徑的調(diào)控，赤霉素途徑扮演了重要的角色，成為了必須的調(diào)控途徑[23]。田間原位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遮蔭會減少胡椒抽穗數(shù)目，從本研究結(jié)果看，這與激素含量相關(guān)性較小，盡管遮蔭降低了IAA/ABA，但是降低效果不顯著；遮蔭沒有增加胡椒花穗脫落數(shù)，推測是因?yàn)檎谑a條件下胡椒GA3/ABA沒有顯著降低，所以，適度提高GA3/ABA比值是保證花穗不脫落的關(guān)鍵因素。

綜上所述，光強(qiáng)改變可以通過影響胡椒光合作用和激素含量調(diào)控胡椒花穗數(shù)目。本研究發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)調(diào)控激素含量影響胡椒成穗的原因有2方面：首先，在光強(qiáng)不適宜條件下，如果光強(qiáng)可以誘導(dǎo)胡椒葉片ABA含量增加、氣孔導(dǎo)度降低，就可能會導(dǎo)致成穗數(shù)目增加；其次，在光強(qiáng)不適宜條件下，GA3/ABA比值過低就會導(dǎo)致胡椒花穗脫落。所以，生產(chǎn)中應(yīng)確保穩(wěn)定葉片中GA3/ABA比值在1.5～2.0范圍內(nèi)，在主花期選擇適宜的光強(qiáng)或噴施GA3和ABA等生物刺激素，可以提升葉片光合作用，增加成穗數(shù)目；非主花期采用遮蔭或噴施刺激素的技術(shù)手段降低葉片GA3/ABA比值，使花穗脫落，可以減少樹體養(yǎng)分損失，節(jié)約人工摘花成本。