章國永，王曉杜

(蒼南縣動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 溫州 325800；2.浙江農(nóng)林大學(xué))

豬呼吸道疾病，臨床以咳嗽、氣喘、張口呼吸、生長緩慢為特征，病理剖檢以肺部發(fā)生肉樣或肝樣病變，肺門淋巴結(jié)腫大為主，在全世界廣泛流行。單純感染豬肺炎支原體的豬只死亡率較低，但發(fā)病率高，且常常誘發(fā)其他病原微生物感染，引起臨床癥狀加重、病死率增加，給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]?？梢酝ㄟ^體外培養(yǎng)、多克隆抗體免疫熒光法[2-3]、PCR[4]等方法對豬肺炎支原體進行診斷。但是體外培養(yǎng)條件苛刻，現(xiàn)在常常用PCR的方法進行快速診斷。

1 發(fā)病情況

杭州某地方品種豬場，存欄300多頭，該場管理不規(guī)范，沒有進行正規(guī)的群體性免疫。在2014年7-8月份，筆者在該豬場實習(xí)，期間發(fā)現(xiàn)該場豬群出現(xiàn)與豬喘氣病相似的臨床癥狀。豬群呈群體性間歇性咳嗽，3-4月齡的育肥豬呈現(xiàn)張口喘氣(時間持續(xù)在30 s左右)，間歇性的咳嗽，劇烈運動后更加明顯，腹式呼吸，甚至犬坐式呼吸等呼吸道疾病癥狀。病豬精神萎靡、食欲不振、生長緩慢，漸行性消瘦。有些病豬體溫升高至41～42℃，到病程后期，體溫低下，呼吸極度困難，伴有泡沫狀的口鼻分泌液，死亡后4～5 h有帶血樣的鼻液流出(見圖1所示)。5月齡及以上的育肥豬，表現(xiàn)為運動氣喘、拱背伸頸、咳嗽、毛發(fā)粗糙，未見豬只死亡。

圖1 病豬臨床癥狀

2 病理剖檢結(jié)果

病理變化尸體剖檢眼觀病變主要在肺部。剖檢病豬10頭，可以發(fā)現(xiàn)9頭肺葉有病變跡象，肺腫大、出血，呈暗紅色、灰白色、淺紅色，界限明顯(如圖2-1、圖2-3所示)。硬度增加，外觀呈“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變(如圖2-2、圖2-4所示)。7頭頜下淋巴結(jié)、腸系膜、腹股溝等處淋巴結(jié)腫大出血或壞死。其中有1頭病死豬病程一周多，每天用抗生素治療，死后發(fā)現(xiàn)該豬腸系膜粘連，胰臟、脾臟等器官萎縮壞死，皮膚出現(xiàn)紫色斑點。采集病死豬，病變明顯的器官，肺臟、淋巴、小腸、脾臟等，用于后續(xù)實驗室診斷。

圖2 病死豬剖檢結(jié)果

3 實驗室診斷方法與結(jié)果

根據(jù)參考文獻報導(dǎo)[5]，豬肺炎支原體(ATCC 25934)外顯性p36(948 bp) 蛋白基因，構(gòu)建檢測豬肺炎支原體(948 bp)引物FSp36-RSp36，根據(jù)豬鼻支原體p37外顯性蛋白基因，構(gòu)建一對引物：Sp37-Asp37，用于檢測豬鼻支原體(346 bp)。豬圓環(huán)病毒由浙江農(nóng)林大學(xué)申老師實驗室根據(jù)PCV2的ORF2基因設(shè)計的引物P20RF2F-P20RF2R，對病料進行PCR擴增鑒定后，送至上海生物工程有限公司合成，引物名稱、核苷酸序列、目的基因大小如表1所示。

表1 PCR引物名稱及其序列

3.1圓環(huán)病毒鑒別診斷 圓環(huán)病毒感染可引起豬群免疫損傷，是引起豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的病原體之一。而該養(yǎng)殖場豬群以呼吸道疾病為主，病死豬很可能因為豬群免疫損傷繼發(fā)支原體感染，導(dǎo)致死亡率增加，故有必要對豬群進行PCV2的鑒別診斷。

用引物(P2ORF2F-P2ORF2R)檢測豬圓環(huán)病毒(667 bp)。結(jié)果如圖3所示。2-10號樣電泳結(jié)果呈陽性，陽性率80%(95% CI=44.4%, 97.5%)，表明這8頭豬均受到圓環(huán)病毒感染。

圖3 圓環(huán)病毒-ORF2基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

3.2豬鼻支原體檢測結(jié)果 豬鼻支原體，也可粘附到豬的呼吸道上皮細胞上，引起豬的肺炎，還可能引起漿膜炎、中耳炎等臨床癥狀[6]，為了與豬肺炎支原體做出鑒別診斷，本研究用引物(Sp37-Asp37)檢測10頭病死豬肺部組織樣本，結(jié)果如圖4所示，僅9號樣電泳結(jié)果呈陽性，陽性率10%(95% CI=0.3%, 44.5%)，表明10頭豬中僅一頭豬受到鼻支原體感染，說明該養(yǎng)殖場主要的病原不是豬鼻支原體。

圖4 豬鼻炎支原體-p37基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

3.3豬肺炎支原體檢測結(jié)果 用該對引物(FSp36-RSp36)檢測10頭病死豬肺部組織樣本，結(jié)果如圖5所示。3、4、6、7、8、9號樣電泳結(jié)果呈陽性，其中3、6號樣本呈弱陽性，陽性率60%(95% CI=26.2%, 87.8%)。表明這6頭豬均受到豬肺炎支原體感染，初步說明該病的病原體為豬肺炎支原體。

圖5 豬肺炎支原體-P36基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

4 討論與結(jié)論

豬氣喘病是地方性豬場的慢性呼吸道疾病，不同品種、性別、年齡的豬均可感染豬肺炎支原體，引起豬的氣喘病。本研究對10頭病死豬進行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)肺出血，呈暗紅色、淺紅色，“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變。采集處理病死豬的肺臟，用PCR方法進行實驗室診斷，結(jié)果顯示：圓環(huán)病毒陽性率80%(CI 95%=44.4%-97.5%)，豬鼻支原體陽性率10%(CI 95%=0.3%-44.5%)，豬肺炎支原體陽性率60%(CI 95%=26.2%-87.8%)。說明該豬場很可能嚴重受到PCV2污染，引起豬免疫損傷，造成免疫力低下，繼發(fā)支原體感染，增加死亡率。豬鼻支原體的陽性率遠低于豬肺炎支原體，說明該豬場的氣喘病很可能是由于豬肺炎支原體引起。

結(jié)合臨床癥狀、病理剖檢和PCR診斷三者的結(jié)果，表明該豬場確實受到圓環(huán)病毒和肺炎支原體混合感染。該養(yǎng)殖場豬圓環(huán)病毒疫苗和豬肺炎支原體疫苗是不納在常規(guī)疫苗之內(nèi)的，建議豬場將這兩種疫苗列入免疫計劃之內(nèi)，并加強飼養(yǎng)管理，建立科學(xué)養(yǎng)殖觀念。