水果酵素自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群與有機酸變化規(guī)律分析

李希羽，高 潔，李云姣，王兆凌，張兆熙，桑亞新

（河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

隨著人們生活水平的提高，對功能性食品的需求與日俱增。酵素以其豐富的營養(yǎng)成分、活性物質和健康益處，在亞洲國家深受青睞[1]。水果酵素是以水果為原料，經過有益微生物群發(fā)酵得到的發(fā)酵產品。在發(fā)酵過程中通過微生物對水果自身營養(yǎng)及外加碳源的代謝，使得酵素體系中含有豐富的有機酸、酶、小分子氨基酸等代謝產物[2-3]，具有多種有益功能活性[1]，受到消費者及學術界的廣泛關注。

酵素的發(fā)酵方式分為接菌發(fā)酵和自然發(fā)酵，接菌發(fā)酵是利用一種或者多種微生物作為起始發(fā)酵劑進行發(fā)酵[4]。 自然發(fā)酵主要是依賴于水果和自然環(huán)境中的優(yōu)勢菌群進行發(fā)酵，具有更豐富的微生物組成和代謝過程，其品質和風味也優(yōu)于接菌發(fā)酵。然而在自然發(fā)酵過程中，酵素體系中的微生物群落構成不斷變化，生成不同的代謝物，且又受到代謝產物的影響，使其發(fā)酵規(guī)律難以掌控。目前關于酵素的研究主要是微生物群落或產物因子的單一研究，高慶超等[5]通過高通量測序對黑果枸杞酵素在0～60 d中的微生物群落結構變化進行了研究，杜麗平等[6]通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）研究了木瓜自然發(fā)酵酵素在0～42 d中的微生物多樣性變化，楊小幸等[2]對自然發(fā)酵蘋果酵素的物質代謝變化和抗氧化性進行研究。在實際生產中，發(fā)酵過程中不同時間的微生物群落結構與代謝物的變化規(guī)律與酵素的品質、功能和安全性密切相關，發(fā)酵時間選擇和過程調控需要結合微生物的群落結構變化以及產物實際情況進行綜合考慮。其中有機酸既被微生物用作碳源和電子供體，又是微生物的發(fā)酵產物，有機酸積累所導致的酸性環(huán)境還對某些微生物有抑制作用。因此，亟待進行水果酵素發(fā)酵過程中的微生物群落與有機酸產物的動態(tài)變化綜合分析與評價，這有助于闡明水果酵素的發(fā)酵過程，控制酵素產品品質，同時對酵素工業(yè)化生產具有重要意義。

本實驗以3 種物料與糖典型比例的水果酵素為研究對象，研究其在發(fā)酵周期0～150 d不同發(fā)酵時期的微生物動態(tài)變化以及7 種主要有機酸變化過程，運用冗余分析（redundancy analysis，RDA）對微生物群落組成與有機酸變化聯(lián)合分析，以期揭示水果酵素在自然發(fā)酵過程中的微生物共性演變規(guī)律及在演替過程中有機酸的環(huán)境推動力，為指導自然發(fā)酵水果酵素實際生產、實現(xiàn)水果酵素工業(yè)生產工藝改進和產品品質穩(wěn)定提升提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果、香蕉、梨、山楂、火龍果、香橙、檸檬、柚子、葡萄、獼猴桃、紅糖（一級品）、白砂糖（一級品）市購。

有機酸標準品 上海源葉生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索萊寶生物科技有限公司；β-巰基乙醇、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 美國Sigma公司；RNase、6×loading bufferv北京康為世紀 公司；PCR引物 深圳華大基因科技服務有限公司；其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

K5600型超微量分光光度計 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；Multiskan FC酶標儀 美國Thermo公司；TGL 16M高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；S1000TM PCR儀、PowerPac電泳儀 美國Bio-Rad公司；Tanon 4600SF全自動數(shù)碼凝膠/化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取原料水果，等質量比混勻，無菌水清潔表面，均勻切塊。結合預實驗發(fā)酵情況與其他研究[7-9]選擇糖與物料的比例與發(fā)酵時間，將水果與紅糖以質量比1∶1、2∶1、3∶1（水果酵素A、B、C）加入滅菌發(fā)酵罐中，封口，自然發(fā)酵，分別在發(fā)酵0、30、60、90、120 d取樣，10 000 r/min離心10 min棄去沉淀，上清液即為水果酵素原液，-20 ℃條件下保存待測。

1.3.2 有機酸含量測定

待測樣品用5%氨水調節(jié)pH 8.2，經SAX強陰離子柱純化。甲醇活化小柱，純凈水平衡，取0.5 mL調節(jié)pH值后的樣品過柱，控制流速1 mL/min，純凈水淋洗，6% HCl溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹，純凈水定容。樣品過0.45 μm微孔濾膜后用于高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件[10-11]：色譜柱為C18柱；流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH 2.7（用磷酸調節(jié)）；等梯度洗脫20 min；流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長210 nm；檢測溫度30 ℃。

1.3.3 微生物多樣性分析

1.3.3.1 樣品總DNA擴增

根據CTAB法[12]提取樣品中DNA。樣品細菌DNA經過2 輪擴增后進行DGGE分析。首先使用F27和R1541對DNA全長片段嘗試第1輪擴增，然后使用帶夾板的F338-GC和R518對細菌16S rDNA的V3區(qū)進行第2輪擴增，用于DGGE分析。實驗所用的引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers targeting bacteria and fungi used in this study

細菌PCR體系（50 μL）：25 μL Mix、20 μL ddH2O、2 μL F27（F338-GC）、2 μL R1541（R518）、1 μL模板。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。之后采用凝膠成像系統(tǒng)成像，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 DGGE與條帶測序

對樣品提取DNA的PCR產物進行DGGE檢測。經過反復實驗確定變性劑梯度范圍25%～55%，Bisacrylamide為10%。兩種不同變性濃度的溶液，分別加入13 μL四甲基乙二胺和65 μL 10%過硫酸銨溶液，迅速混勻，灌膠。待膠凝固后加入電泳裝置，加入1×TAE緩沖液，緩沖液加熱至60 ℃，在每個加樣孔上樣25 μL，200 V預電泳5 min，之后調整電壓為120 V，電泳時間6 h。電泳結束后，取出膠板，去離子水清洗，加入固定液固定15 min，之后銀染、顯色、終止。使用凝膠成像儀觀察凝膠，并拍照記錄。采用Quantity One軟件標記特異性條帶，并回收條帶，加入20 μL超純水，在4 ℃過夜溶解凝膠塊中的DNA。取5 μL凝膠浸出液進行PCR擴增，所用引物為不帶夾板的F338和R518（表1）。電泳檢測回收，由華大基因進行克隆測序，測序結果進行BLAST序列同源性比對[15-16]。

1.4 數(shù)據分析

采用軟件Quantity One讀取DGGE圖譜上條帶的數(shù)目與光密度值，并進行UPMGA（非加權組平均算法）聚類分析，生成DGGE圖譜相似性分析圖，并根據DGGE數(shù)字化后的數(shù)據計算微生物多樣性指數(shù)，包括微生物多樣性指數(shù)、豐富度和均勻度指標，其按 式（1）、（2）計算：

式中：H為Shannon-Wiener指數(shù)；S為PCR-DGGE膠中條帶數(shù)量（豐富度）；Pi為i條帶所占百分比；EH為均勻度指數(shù)。

參考于松峰等[17]的方法分別建立微生物豐度和有機酸的矩陣，微生物豐度數(shù)據使用百分比，利用Canoco for Windows 4.6 用于相關性分析。首先對物種數(shù)據進行去趨勢對應分析（detrended correspondence analysis，DCA），根據每個排序軸的梯度長度對應選擇單峰模型或線性模型，隨后對其進行相應的模型排序分析，研究微生物群落組成與其代謝產物中多種有機酸的相關性。其他數(shù)據顯著性分析使用SPSS 25.0。

2 結果與分析

2.1 有機酸的測定結果

圖1 有機酸標準品（A）與樣品A 0 d（B）高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of organic acid standards (A) and organic acids in fermented fruits A (B)

如圖1所示，乳酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸是水果酵素中的主要有機酸，同時還含有少量的酒石酸、莽草酸和綠原酸，這與張思等[18]關于市售酵素的研究結果相似，其發(fā)現(xiàn)在16 種市售酵素中含量較多的主要是乳酸和檸檬酸。

圖2 水果酵素A、B、C在發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Fig. 2 Changes in organic acid contents in fermented fruits A, B and C during fermentation

如圖2所示，在發(fā)酵前后酵素中主要有機酸含量均發(fā)生變化。其中乳酸在有機酸中占比最高、變化最大，發(fā)酵0 d檢測到樣品A、B、C質量濃度為2.92～3.70 mg/mL， 在發(fā)酵過程中先增大后減小，在發(fā)酵120 d質量濃度為7.19～10.49 mg/mL。這可能由于乳酸菌發(fā)酵產生乳酸，導致發(fā)酵液pH值下降，而過低的pH值則會抑制乳酸菌的生長，此外，許多微生物可以在體內代謝將乳酸降解[19]。檸檬酸占比次之，發(fā)酵120 d質量濃度為5.79～7.93 mg/mL。乳酸菌可通過三羧酸循環(huán)產生檸檬酸，同時還可將檸檬酸分解產生乳酸。草酸、酒石酸、蘋果酸含量在發(fā)酵過程中下降，可能是菌群的代謝作用導致；蘋果酸含量在發(fā)酵90 d下降至0，是由于在發(fā)酵過程中乳酸菌可將蘋果酸降解為乳酸，并釋放CO2。水果酵素中莽草酸在發(fā)酵過程中含量增加，在發(fā)酵0、30 d未檢測到，但在發(fā)酵60、90、120 d檢測到質量濃度在0.01～0.06 mg/mL范圍內，這可能是微生物通過莽草酸途徑產生莽草酸；綠原酸質量濃度約0.01 mg/mL，在檢測范圍內無明顯變化規(guī)律。

此外，不同樣品在發(fā)酵不同階段有不同的有機酸變化，水果酵素A的草酸與檸檬酸在發(fā)酵30 d出現(xiàn)峰值，乳酸在發(fā)酵90 d出現(xiàn)峰值；水果酵素B的草酸與乳酸在發(fā)酵60 d出現(xiàn)峰值，檸檬酸在90 d含量最高；水果酵素C的草酸在發(fā)酵60 d出現(xiàn)最大值，在發(fā)酵90 d乳酸與檸檬酸出現(xiàn)最大值。不同糖與物料比的水果酵素在自然發(fā)酵過程中可以有針對性地選擇合適的發(fā)酵階段，保障酵素功能品質。

2.2 水果酵素發(fā)酵過程中的微生物多樣性

2.2.1 PCR-DGGE分析

采用CTAB法提取水果酵素總DNA，測得A260nm/A280nm為1.79。以F27、R1541為引物進行一輪擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示目標條帶大小約為1 000 bp。以一輪PCR產物為模板，以F338-GC、R518為引物，對DNA中16S rDNA V3區(qū)擴增分析，結果顯示目標條帶約為200 bp。其PCR-DGGE圖譜見圖3。

圖3 水果酵素的細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜（A）及 條帶簡圖（B）Fig. 3 DGGE profile (A) and bands (B) of PCR-amplified 16S rDNA V3 regions from fermented fruits A, B and C

如圖3所示，每條泳道代表不同發(fā)酵時間的水果酵素細菌的DGGE圖譜，不同位置的條帶則代表不同種屬的微生物，條帶亮度反映微生物豐度高低，條帶數(shù)量代表菌落多樣性。由圖3可知，各條帶的遷移率及光密度值均有一定差異，可以判斷3 種水果酵素在發(fā)酵過程中細菌種類和含量均在不斷發(fā)生演替變化。如：條帶a、d在泳道4～8光密度值增加，可能是發(fā)酵中期的優(yōu)勢菌；條帶m、o存在于泳道1、2、3中，說明對應的菌可能是發(fā)酵前期的非優(yōu)勢菌種，在發(fā)酵后期被其他因素抑制以至消失；在16、17、18泳道上條帶數(shù)增加，菌種多樣性增加，后期發(fā)酵條件不適宜優(yōu)勢菌群繼續(xù)生長。

從18 份樣品的DGGE圖譜上共標記出19 條特異性條帶，對條帶進行克隆測序，將檢測出的條帶序列在NCBI數(shù)據庫中進行BLAST比對分析，結果如表2所示。

表2 不同發(fā)酵階段的水果酵素樣品中細菌16S rDNA V3區(qū) PCR-DGGE特異性條帶鑒定結果Table 2 Identification of PCR-DGGE bands of PCR-amplified bacterial 16S rDNA V3 regions from fermented fruits A, B and C through BLAST comparison with GenBank

由表2可知，在水果酵素樣品細菌DNA的DGGE圖譜上找到19 條特異性條帶，對其進行分析的結果為：7 株乳酸菌，2 株瓊脂酶產生菌（Brevundimonassp.）， 2 株腸桿菌（Enterobacters p.）、1 株腸球菌（Enterococcussp.），2 株假單胞菌（Pseudomonassp.），以及3 株不可培養(yǎng)微生物，另外有2 株菌未檢測到。并且，測序結果在GenBank數(shù)據庫比對，發(fā)現(xiàn)同源性均大于99%。條帶b、c、d、h、r的比對結果分別為乳酸乳球菌（L. lactissubsp.）2 株、短乳桿菌 （L. brevis）、植物乳桿菌（L. plantarum）和不可培養(yǎng)乳球菌（unculturedLactococcussp.），這些條帶出現(xiàn)在各發(fā)酵時間的樣品中。條帶i、j、k的比對結果分別是腸球菌（Enterococcussp.）、陰溝腸桿菌（E. cloacae）、不可培養(yǎng)微生物（uncultured bacterium），條帶m、o沒有比對出結果，可以再進行進一步的研究，這些條帶存在于樣品1、2、3中，即主要出現(xiàn)在發(fā)酵0 d的酵素中，此外條帶j、m也在發(fā)酵120 d酵素檢測到。條帶a、l、q分別為L. plantarum、香坊腸桿菌（E. xiangfangensis）和uncultured bacterium，主要出現(xiàn)在樣品4～14中。條帶e、g、n、p、s的比對結果分別為uncultured bacterium、Pseudomonassp.、Brevundimonassp.、不可培養(yǎng)嗜麥芽窄食單胞菌（unculturedStenotrophomonassp.）、不可培養(yǎng)瓊脂糖酶產生菌（unculturedBrevundimonassp.），主要存在于樣品15～18中，即發(fā)酵120 d的樣品。

本研究發(fā)現(xiàn)不同的糖與物料比影響水果酵素初始環(huán)境的滲透壓，也影響發(fā)酵過程中多種微生物群落的含量變化和優(yōu)勢菌群，因此在相同發(fā)酵階段，不同樣品的泳道條帶數(shù)與亮度存在異同。同一樣品在不同發(fā)酵階段的菌群變化也十分明顯。在第0天時L. lactissubsp.是水果酵素的優(yōu)勢乳酸菌，它生長快速，代謝簡單，可分解碳水化合物生成乳酸，常見于植物產品和乳制品，其安全性被公認[20]。L. brevis也在0 d出現(xiàn)，作為乳酸菌中重要的菌屬，常見于泡菜中[21]。Enterococcussp.、E. cloacae普遍存在于自然發(fā)酵初期，Kung等[22]曾在芥菜泡菜里分離到E. cloacae。在30～120 d發(fā)酵過程中，Enterococcussp.、E. cloacae條帶亮度減弱甚至消失。在發(fā)酵30 d時L. plantarum條帶變亮，含量增加。在發(fā)酵60、90、120 d的L. plantarum、L. lactissubsp.、L. brevis是該階段優(yōu)勢菌。Lactococcus與Lactobacillus以果糖和外源糖類作為碳源進行代謝，產生乳酸等有機酸，使發(fā)酵液pH值下降，抑制雜菌生長。當酵素發(fā)酵到150 d時，DGGE圖譜上條帶數(shù)量明顯變多，出現(xiàn)了Pseudomonassp.、Brevundimonassp.、Stenotrophomonassp.等腐敗菌，說明此時樣品中優(yōu)勢菌群已經受到影響。Pseudomonassp.是嚴格好氧菌，在酸菜、腌制菜[23]中曾分離到，因此發(fā)酵過程中應控制嚴格厭氧以減少污染。于美玲[24]對不同發(fā)酵階段的酸菜中的細菌多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)明串珠菌在發(fā)酵前期占主導地位以啟動酸菜發(fā)酵，L. coryniformis、L. fermentum和L. plantarum在發(fā)酵中期占有優(yōu)勢地位直至酸菜發(fā)酵成熟。本研究與其研究所涉及的微生物變化規(guī)律與熊濤等[25]研究結果相近，在自然發(fā)酵果蔬的過程中，異型乳酸發(fā)酵菌通常在發(fā)酵初期為優(yōu)勢菌群，有助于啟動發(fā)酵，其產酸能力相對較弱。在發(fā)酵中后期，產酸能力較強的同型乳酸發(fā)酵菌逐漸成為優(yōu)勢菌群。

2.2.2 PCR-DGGE結果聚類分析

如圖4所示，0 d與其他階段酵素的細菌菌群相似性較小，說明酵素在發(fā)酵后菌群變化較大；30 d后的水果酵素相似性較大，其中水果酵素B、C發(fā)酵30 d與60 d樣品較為接近，與0 d樣品具有較為明顯的差異，可能是由于水果酵素B、C在該階段有相似度較高的細菌種群結構。除此之外，水果酵素A在60 d與90 d的群落較為相近，可能是水果酵素A在發(fā)酵過程中的細菌菌群交替生長的結果。

圖4 水果酵素的細菌DGGE指紋圖譜聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of DGGE profiles for bacterial communities in different fermented fruits

2.2.3 細菌種群多樣性PCR-DGGE分析

由表3可知，不同樣品中細菌種群的均勻度較為接近，但是豐富度和多樣性指數(shù)差別較大。0 d時樣品具有較高的豐富度和多樣性，可能是由于發(fā)酵初期菌群不穩(wěn)定，微生物均為果蔬內部或表皮攜帶的自然菌群；隨著發(fā)酵進行，部分細菌逐漸占據優(yōu)勢地位，可以維持菌群結構的穩(wěn)定。在發(fā)酵后期，泳道18（水果酵素C發(fā)酵150 d）中多樣性指數(shù)和豐度最高，分別為2.76和16.00，可能是由于該發(fā)酵階段優(yōu)勢菌群衰竭，也可能由于雜菌的污染。此結果和DGGE圖譜的直觀觀測結果一致。

表3 水果酵素細菌菌群多樣性分析Table 3 Analysis of bacterial community diversity in fermented fruits

2.3 相關性分析

為進一步研究微生物群落變化與酵素內有機酸含量變化的對應關系，首先對物種特征進行了DCA，結果顯示物種數(shù)據適用于線性模型，即使用RDA更為準確。RDA結果見表4，第1軸與第2軸特征值分別為0.396和0.150，微生物群落與有機酸的相關性分別為0.958和0.950，累積典范特征值為0.688，蒙特卡羅檢驗值小于0.05，因此排序結果可以在一定程度上解釋微生物群落組成與環(huán)境有機酸含量之間的相互關系。

表4 RDA結果Table 4 Statistic data of RDA

圖5 微生物群落與有機酸變化RDAFig. 5 RDA of bacterial community and organic acids

從圖5可知，不同時期的樣品主要分布在3 個區(qū)域。發(fā)酵0 d的3 種酵素位置相對較為集中，分布在A區(qū)域，該區(qū)域分布的細菌包括unculturedbacterium（k）、unidentified（m）、Enterococcussp.（i）和unidentified（o），該區(qū)域的細菌對于酒石酸和蘋果酸的影響最大。B區(qū)域集中了大部分發(fā)酵30、60、90 d的酵素樣品，分布的細菌包括L. lactissubsp.（c）、L. plantarum（a）、E. xiangfangensis（l）、L. lactissubsp.（b）和L. brevis（d），該區(qū)域的細菌與草酸和綠原酸的相關性較高。C區(qū)域分布著發(fā)酵60 d之后的大部分酵素樣品，與乳酸、檸檬酸、莽草酸的相關性較高，分布在該區(qū)域的細菌有unculturedLactococcussp.（r）、unculturedbacterium（q）、L. plantarum（f）和unculturedStenotrophomonassp.（p）。

A區(qū)域集中了發(fā)酵前果蔬中自然存在的天然菌群，與30 d發(fā)酵后的酵素樣品相差較大，與酒石酸、蘋果酸呈正相關，與其他有機酸均呈負相關。B區(qū)域中，草酸與綠原酸向量夾角極小，說明在酵素發(fā)酵過程中，綠原酸和草酸相關性極強，是協(xié)同產生的。C區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)乳酸、檸檬酸、莽草酸向量夾角較小，推測是協(xié)同產生。此外，可以分析出對乳酸生成貢獻率較大的菌株（不可培養(yǎng)菌株菌不計算在內）分別為：L. plantarum（a）＞L. plantarum（f）＞L.lactissubsp.（b）＞E. xiangfangensis（l）＞L. lactissubsp.（c）＞unculturedLactococcussp.（r）。產生乳酸的主要菌種主要是L. plantarum和L. lactis，這與其他文獻中乳酸的產生菌大體符合[25-27]，說明通過RDA分析方法探究酵素中微生物群落與有機酸之間的關系的結果是可信的。L. lactis和L. plantarum主要通過同型乳酸發(fā)酵方式產生乳酸，即葡萄糖通過糖酵解途徑降解形成丙酮酸，丙酮酸被乳酸脫氫酶催化還原生成乳酸。其中，L. lactis以產L-乳酸為主，植物乳桿菌則可產生DL-乳酸[28-29]。L. brevis則主要進行異型乳酸發(fā)酵，除了產生乳酸以外，還可以產生少量的其他有機酸，如琥珀酸。與同型乳酸發(fā)酵菌相比，消耗等量的葡萄糖產生乳酸較少。因此，水果酵素在發(fā)酵前期乳酸菌通過代謝產生大量的乳酸，導致pH值下降，總酸含量增加。在發(fā)酵后期，一方面葡萄糖作為主要的碳源基本被利用，另一方面體系的低pH值會對乳酸菌產生一定的抑制作用，從而導致乳酸菌代謝緩慢，因此乳酸含量的增加比前期較少。

從圖5還可分析出，對檸檬酸生成貢獻率較大的菌株分別為：L. plantarum（f）＞L. plantarum（a）＞unculturedBrevundimonassp.（s）＞E. xiangfangensis（l）＞ unculturedLactococcussp.（r）。水果酵素中的乳酸菌也可以對蘋果酸、檸檬酸進行代謝，導致在發(fā)酵過程中蘋果酸含量下降，檸檬酸含量增加。熊濤等[26]在對傳統(tǒng)泡菜中有機酸含量的變化進行研究時也發(fā)現(xiàn)了相似的變化規(guī)律，由于微生物的代謝作用，乳酸在發(fā)酵過程中穩(wěn)定增長，檸檬酸和蘋果酸含量均呈現(xiàn)先增加后下降最終保持穩(wěn)定的趨勢。

3 結 論

本研究應用RDA方法對微生物在水果酵素發(fā)酵過程中微生物組成結構變化與標志性產物有機酸之間的對應關系進行了研究，證實了RDA在微生物群落變化與有機酸相關性分析中的可行性，確定在發(fā)酵過程中與特征物質生成與代謝有關的主要微生物，對闡明水果酵素發(fā)酵過程、指導水果酵素生產加工技術有重要參考價值。RDA表明對檸檬酸生成貢獻率較大的菌株分別為L. plantarum＞unculturedBrevundimonassp.＞E. xiangfangensis＞unculturedLactococcussp.，對乳酸生成貢獻率較大的菌株分別為L. plantarum＞L. lactissubsp.＞E. xiangfangensis＞L. lactissubsp.＞unculturedLactococcussp.。本研究得到有機酸與微生物群落共性變化規(guī)律，有助于以有機酸為指標進一步控制水果酵素中微生物發(fā)酵過程和品質，切實指導實際生產。