植物乳桿菌D1501發(fā)酵黃漿水的抑菌活性及其中細菌素的分離與鑒定

陸 洲，戴意強，Hafiz Abdul RASHEED，吳 寒，夏秀東，董明盛,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

豆制品作為中國的傳統(tǒng)食品，深受人們喜愛。在傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)過程中，為了保持特定的含水量和彈性，必須施加一定的壓力排出多余的“廢水”。由于其為棕黃色膠體混合物，因此被稱為黃漿水（也稱大豆乳清）[1]。 我國黃漿水產(chǎn)量極大，據(jù)統(tǒng)計每年約有0.55～0.7億 t黃漿水產(chǎn)生[2]。由于豆制品企業(yè)規(guī)模小、分布散，黃漿水集中處理難度大成本高，生產(chǎn)過程中黃漿水常被當作廢水直接排放到環(huán)境中，加工利用程度很低，資源浪費嚴重，也造成嚴重的環(huán)境污染[3]。黃漿水富含色素、鹽類、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物，極易為微生物利用快速生長繁殖。黃漿水經(jīng)微生物發(fā)酵酸化形成酸漿，只有很少一部分被重新利用制成豆腐酸凝劑，大部分都被視為廢棄物直接排放[4]。這無形中又增加了環(huán)境污染，形成一種惡行循環(huán)。因此，合理利用酸漿實現(xiàn)黃漿水的回收利用具有很大現(xiàn)實意義。

細菌素是某些細菌在代謝過程中，通過核糖體合成機制產(chǎn)生并釋放到胞外的對同種或親緣關(guān)系較近的菌株一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)[5-6]。相比其他化學(xué)防腐劑，細菌素在胃腸道中可被蛋白酶降解，因其天然、高效、耐高溫、無殘留、無抗藥性以及良好的生物相容性等優(yōu)點，常作為食品中的天然生物防腐劑，也常被用作飼料添加劑以及應(yīng)用于醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景[7-12]。

細菌素的分離純化是解析細菌素結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的重要基礎(chǔ)，可為實現(xiàn)細菌素在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。目前國內(nèi)外已經(jīng)有上百種細菌素被純化出來，形成了較為成熟的純化體系。但由于細菌本身的特異性，純化方法很難統(tǒng)一。通常根據(jù)細菌素分子質(zhì)量大小、疏水性、陰陽離子性等特點進行分離純化。純化過程通常分為3 個階段：粗提、初步純化和精細純化。細菌素的粗提取主要采用硫酸銨沉淀法、丙酮低溫沉淀法、有機溶劑萃取法和菌體吸附解析法等方法[13-16]。其中硫酸銨沉淀法在大多數(shù)細菌素的粗提中被廣泛應(yīng)用，而有機溶劑萃取法由于工序復(fù)雜已基本被淘汰。初步純化的目的是去除大量的雜蛋白，得到50%～90%純度的細菌素用于精細純化，通常采用凝膠層析和離子交換色譜法[17]。 精細純化是對細菌素進行進一步高度純化，去除痕量的干擾雜質(zhì)，使細菌素純度達到99%，便于質(zhì)譜分析其分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)以及進行氨基酸測序，這一階段采用的方法主要是高效液相色譜法[18]。

本課題組已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌D1501是細菌素的產(chǎn)生菌，其利用MRS（de Man Rogosa Sharpe）瓊脂可以產(chǎn)生大分子細菌素。本實驗以綜合利用黃漿水及其酸漿為出發(fā)點，以植物乳桿菌D1501發(fā)酵黃漿水形成的酸漿為研究對象，采用超濾分離、RESOURCE-Q陰離子交換層析、C18柱反相層析、二次反相層析等方法，分離得出高純度細菌素，并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法分析測定細菌素的分子質(zhì)量和氨基酸組成。從而為深入研究其理化性質(zhì)提供基礎(chǔ)，為利用酸漿產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)新型生物防腐劑提供理論依據(jù)，為實現(xiàn)黃漿水資源的綜合利用和保護環(huán)境提供新的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌D1501，從貴州省劍河侗族酸肉中分離得到；其他指示菌株均為實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

黃漿水由南京果果豆制品有限公司提供，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用；MRS培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂（trypticase soy-yeast extract agar，TSA-YE）固體培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；過氧化氫酶、脂肪酶、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、 考馬斯亮藍G250（分析純）、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（分析純）、三氟乙酸（色譜純）、 乙腈（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司； Powerdry LL3000冷凍干燥機 美國Heto公司； WD-9405A型脫色搖床 北京六一儀器廠；BF260生化培養(yǎng)箱 德國Binder公司；CP1502電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；PHSJ-5實驗室PH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BGG-907(A)電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司；G154TW立式自動壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；ST16R高速冷凍離心機、Thermo超凈工作臺、BSC.1300.B2生物安全柜 賽默飛世爾科技公司；Hei-VAP Advantage（HL）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；?KTA Purifier 10二維液相色譜系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的制備

將甘油管保藏的植物乳桿菌D1501接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，傳代2 次后備用。

1.3.2 指示菌的活化

將各指示菌按相應(yīng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度傳代2 次后，以1%接種量接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.3.3 酸漿上清液的制備

將傳代2 次的植物乳桿菌D1501以3%接種量接種于黃漿水液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、12 000 r/min低溫冷凍離心15 min后，收集酸漿上清液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 試樣凍干將需要凍干濃縮的液體試樣置于冷凍干燥機， -40 ℃、48 h得到凍干粉。

1.3.5 抑菌活性的測定

采用瓊脂擴散牛津杯法，以游標卡尺測量抑菌圈直徑，以此表示待測樣液的抑菌活性[19]。將無菌牛津杯放于無菌平皿中，將指示菌菌落數(shù)量調(diào)至108CFU/mL，按1%接種量接種于冷卻至46 ℃的LB固體培養(yǎng)基，振蕩混勻后傾注平皿，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子將牛津杯取出，在孔內(nèi)注入200 μL待測樣液，4 ℃擴散5 h后，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.3.6 菌株D1501發(fā)酵黃漿水的抑菌特性

1.3.6.1 菌體殘留細胞抑菌的排除

將酸漿上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后做抑菌實驗，排除離心上清液中殘留菌體細胞對抑菌實驗的影響。

1.3.6.2 酸性產(chǎn)物抑菌的排除

將酸漿上清液pH值調(diào)至6.0后進行抑菌實驗測定活性，以排除代謝產(chǎn)物中乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)對抑菌活性的影響。

1.3.6.3 抑菌物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)的定性

將酸漿上清液的pH值分別調(diào)至H2O2酶（pH 6.0）、胃蛋白酶（pH 2.0）、胰蛋白酶（pH 7.0）、蛋白酶K（pH 7.4）、脂肪酶（pH 7.0）和α-淀粉酶（pH 6.0），然后分別加入6 種酶，使酶的終質(zhì)量濃度分別達到0.1、1.0、2.5、5.0 mg/mL，37 ℃反應(yīng)2 h，沸水浴5 min將酶滅活。將pH值調(diào)至6.0，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌進行抑菌實驗，以未經(jīng)酶處理發(fā)酵上清液的抑菌活性為100%進行相對活性比較，計算相對抑菌活性。

1.3.6.4 抑菌物質(zhì)對溫度的敏感性

取等量酸漿上清液于7 支離心管，分別在-20、4 ℃冰箱放置2 h，在37 ℃水浴2 h，在60、90、100 ℃水浴30 min，以及121 ℃高壓滅菌15 min。放至室溫后，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，測定抑菌活性，以室溫未處理細菌素的抑菌活性為100%進行相對活性比較，計算相對抑菌活性。

1.3.7 細菌素的分離純化

1.3.7.1 超濾分離

將發(fā)酵上清液pH值調(diào)至6.0，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌得到無細胞中性上清液。用30、10、3 kDa的超濾管依次處理中性上清液，將其分為＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa和＞30 kDa四個組分，分別記為組分A、B、C、D，將其體積各自濃縮成25 mL，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，分別測定蛋白含量與抑菌活性。

1.3.7.2 RESOURCE-Q陰離子交換層析

先用20 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液平衡RESOURCE-Q層析柱至電導(dǎo)值恒定不變。上樣量2 mL，流速1.0 mL/min，先以含0～1 mol/L NaCl的Tris-鹽酸（pH 8.0，0.02 mol/L）緩沖液體積分數(shù)15%洗脫，再按15%～50%進行線性洗脫，收集各峰組分，凍干定容至10 mL后，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，測定蛋白含量及抑菌活性。

1.3.7.3 反相高效液相色譜層析

將1.3.6.2節(jié)中有抑菌活性的組分采用反相高效液相色譜300SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分析。洗脫條件為：流動相A：0.1%三氟乙酸溶液，流動相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。0～10 min，95%～75% A，5%～25% B；1 0 ～1 5 m i n，7 5%～7 0% A，2 5%～3 0% B；1 5 ～3 0 m i n，7 0%～4 5% A，3 0%～5 5% B；30～35 min，45%～95% A，55%～5% B。在檢測波長214 nm處收集蛋白峰。分別凍干定容成5 mL，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，測定各組分的蛋白含量及 抑菌活性。

1.3.7.4 二次反相高效液相色譜層析

將測定有抑菌活性的組分，進行二次反相色譜分析。洗脫條件為：流動相A：0.1%三氟乙酸溶液，流動相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。0～10 min，97%～90% A，3%～10% B；1 0 ～2 0 m i n，9 0%～8 5% A，1 0%～1 5% B；20～30 min，85%～97% A，15%～3% B。在檢測波長214 nm處收集蛋白峰。分別凍干定容成1 mL，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，測定各組分的蛋白含量及抑菌活性。

1.3.8 高效液相色譜檢測細菌素純度

將提純的細菌素冷凍干燥后，用體積分數(shù)15%乙腈溶液溶解，用高效液相色譜SHIMADZU Inertsil ODS-SP柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）檢測細菌素純度。洗脫條件為：流動相A：0.1%三氟乙酸溶液，流動相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL。0～25 min，95%～35% A，5%～65% B；25～28 min，35%～5% A，65%～95% B；28～32 min，5% A，95% B；32～35 min，5%～95% A，95%～5% B；在檢測波長214 nm下觀察出峰情況。

1.3.9 LC-MS/MS測定細菌素精確分子質(zhì)量和氨基酸序列

將提純的細菌素冷凍干燥后用15%三氟乙酸溶液溶解，取1 μL進行質(zhì)譜分析。流速為0.2 mL/min， 流動相為5 0%水-5 0%甲醇，在正離子模式下 進行m/z300～200的全掃描，并用Peaks 7.0對所得數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.10 純化方案評價

1.3.10.1 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量，以BSA為標準蛋白溶液，在595 nm波長下測得的吸光度A595nm與蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線并測定各待測液中的蛋白質(zhì)量濃度[20]。

1.3.10.2 細菌素Nisin效價曲線的測定

準確稱取500 mg Nisin標準品（效價106IU/g），溶于50 mL無菌0.02 mol/L的稀鹽酸溶液，配制成104IU/mL的Nisin標準液[21]。用0.02 mol/L HCl依次將104IU/mL的Nisin標準液稀釋成效價為1.0、2.5、5、10、25、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 IU/mL的標準溶液，以金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌，以瓊脂擴散牛津杯法測定抑菌活性。以Nisin效價（IU/mL）的對數(shù)值為橫坐標，以抑菌圈直徑（mm）為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株D1501發(fā)酵黃漿水的抑菌特性

將菌株D1501發(fā)酵黃漿水制備的酸漿中和離心，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到無細胞上清液（D1501酸漿），對其進行抑菌活性檢測。圖1表明，D1501酸漿對指示菌大腸桿菌K-12和金黃色葡萄球菌ATCC6538有明顯抑菌活性，而未發(fā)酵黃漿水沒有檢測到明顯的抑菌作用，表明D1501菌株在黃漿水中產(chǎn)生了有機酸以外的抑菌物質(zhì)。

圖1 未發(fā)酵黃漿水及D1501酸漿對指示菌的的抑制作用Fig. 1 Antimicrobial activities of unfermented soy whey and soy whey fermented by L. plantarum D1501

表1 D1501酸漿的抑菌活性Table 1 Inhibition zone diameters of soy whey fermented by L. plantarum D1501

表1結(jié)果可見，D1501酸漿對供試的植物乳桿菌70810、嗜熱鏈球菌等6 株乳酸菌，金黃色葡萄球菌、李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌等14 株革蘭氏陽性菌，及鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌K-12、大腸埃希氏菌O157:H7、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌等8 株革蘭氏陰性菌有明顯的抑制作用。同時D1501酸漿對假絲酵母表現(xiàn)出弱抑菌活性，但對釀酒酵母和2 株霉菌沒有抑制作用。值得指出的是，D1501酸漿對植物乳桿菌D1501自身沒有明顯抑菌活性，這一結(jié)果暗示該酸漿中的抑菌物質(zhì)可能是一種細菌素，因為Konisky[22]指出細菌素具有自身免疫性。

由表2結(jié)果可知，經(jīng)過氧化氫酶、脂肪酶、α-淀粉酶處理的發(fā)酵上清液的抑菌活性均無明顯變化，表明發(fā)酵上清液中表達抑菌活性的不是H2O2，從而排除了H2O2的抑菌干擾，且抑菌物質(zhì)中不含碳水化合物和類脂物質(zhì)。另一方面經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的3 種蛋白酶處理后，D1501酸漿的抑菌活性明顯下降。當?shù)鞍酌纲|(zhì)量濃度達到5 mg/mL 時抑菌活性均完全消失，說明植物乳桿菌D1501產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感。從而確定D1501酸漿中的抑菌物質(zhì)是多肽或蛋白質(zhì)類的細菌素。

表2 酶處理對D1501酸漿抑制金黃色葡萄球菌ATCC6538活性的影響Table 2 Effects of enzymes on antimicrobial activity of soy whey fermented by L. plantarum D1501

表3 D1501酸漿對溫度的耐受性Table 3 Tolerance to temperature of soy whey fermented by L. plantarum D1501

由表3可知，D1501酸漿抑菌活性受溫度影響較小，經(jīng)低溫或高溫處理一定時間后，抑菌活性均能保持在90%以上。-20、4 ℃處理2 h后能保留97%以上的抑菌活性，37 ℃處理2 h后能保留95.23%的抑菌活性，60、90、100 ℃處理30 min后能保留91%以上的抑菌活性，甚至在121 ℃處理15 min后仍能保留90.04%的相對抑菌活性。結(jié)果表明，D1501酸漿具有良好的熱穩(wěn)定性，可應(yīng)用于食品的熱加工處理中。

2.2 細菌素的分離純化

2.2.1 超濾分離

表4 不同分子質(zhì)量的抑制金黃色葡萄球菌ATCC6538作用Table 4 Antimicrobial activities of ultrafiltration fractions with different molecular masses

如表4所示，相同體積的不同分子質(zhì)量范圍的4 個組分（＜3 kDa，3～10 kDa，10～30 kDa，＞30 kDa）的抑菌活性各不相同。而＜3 kDa分子質(zhì)量的抑菌活性最大，因此挑選這部分組分的蛋白進行下一步分離純化。

2.2.2 RESOURCE-Q陰離子層析

圖2為組分A（＜3 kDa）經(jīng)RESOURCE-Q陰離子交換層析的洗脫曲線，組分1為穿透峰，組分2、3、4為各洗脫峰。將各組分凍干濃縮至10 mL分別測定蛋白含量和抑菌活性。結(jié)果顯示穿透峰無抑菌活性，洗脫峰表現(xiàn)出不同的抑菌活性（表5），而組分2抑菌活性最高，因此挑選組分2進行下一步純化。同時由于該細菌素能被陰離子交換柱吸附，判斷該細菌素帶負電荷。

圖2 RESOURCE-Q離子交換層析洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of bacteriocin by RESOURCE-Q chromatography

表5 不同組分的抑制金黃色葡萄球菌ATCC6538作用Table 5 Antimicrobial activities of fractions from RESOURCE-Q chromatography

2.2.3 反相高效液相色譜層析

圖3為組分2經(jīng)C18柱反相層析的高效液相色譜分離圖，將各峰對應(yīng)的管8、9、10、11、14分開收集，分別命名為組分a～e，將各組分濃縮至5 mL分別測定各組分的蛋白含量和抑菌活性。由表6可知，除組分e外均具有抑菌活性，而組分c抑菌活性最大，因此挑選組分c進行下一步分離純化。

圖3 組分2的高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatogram of fraction 2

表6 不同組分對金黃色葡萄球菌ATCC6538的抑制作用Table 6 Antimicrobial activities of subfractions of fraction 2

2.2.4 二次反相高效液相色譜層析

圖4為組分c經(jīng)C18柱二次反相層析的高效液相色譜分離圖，管6、7為組分I，管8為組分II，管9為組分III，管10為組分IV，管11～13為組分V，將各組分濃縮至1 mL，分別測定蛋白含量和抑菌活性。如表7所示，組分II、III、IV均具有抑菌活性，而組分II的抑菌活性最大，因此選其用于下一步檢測。

圖4 組分c的高效液相色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatogram of subfraction c

表7 二次反相層析不同組分對金黃色葡萄球菌ATCC6538的抑制作用Table 7 Antimicrobial activities of the components of subfraction c

2.2.5 高效液相色譜檢測細菌素純度

圖5 D1501酸漿中細菌素高效液相色譜圖Fig. 5 HPLC profile of bacteriocin in soy whey fermented by L. plantarum D1501

由圖5可知，純化后的細菌素經(jīng)高效液相色譜檢測，只出現(xiàn)單峰，說明該細菌素得到純化，達到色譜純，可用于進一步質(zhì)譜解析。

2.2.6 LC-MS/MS測定細菌素精確分子質(zhì)量及氨基酸序列

通過LC-MS/MS分析（圖6），確定該細菌素分子質(zhì)量約為1 434.90 Da，并通過Peaks7.0軟件分析得出氨基酸序列為MCCKVLLLLSRR。將此氨基酸序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中進行比對，未找到完全匹配的序列。目前，已有多種植物乳桿菌產(chǎn)的細菌素被鑒定報道（表8），通過比較，并未發(fā)現(xiàn)與本研究分離出的細菌素完全一致的報道，判斷該細菌素是一種未被報道的新型乳酸菌細菌素，并命名為Lp100。

植物乳桿菌來源廣泛，多種發(fā)酵食品中都能分離出植物乳桿菌。不同植物乳桿菌菌株發(fā)酵產(chǎn)生的細菌素分子質(zhì)量存在很大差異，但大多數(shù)被純化的植物乳桿菌素都為大分子物質(zhì)，有關(guān)小分子細菌素的報道較少。本實驗室在植物乳桿菌D1501的MRS發(fā)酵液中純化出一種大分子細菌素，分子質(zhì)量62 425 Da，而本實驗從D1501酸漿中純化出的細菌素屬于小分子物質(zhì)，分子質(zhì)量1 434.90 Da。由此可見，細菌素的種類不僅與產(chǎn)生菌株有關(guān)，并且發(fā)酵基質(zhì)的不同也會造成產(chǎn)生的細菌素不同。

圖6 D1501酸漿中細菌素LC-MS/MS圖Fig. 6 LC-MS/MS profile of bacteriocin in soy whey fermented by L. plantarum D1501

表8 不同植物乳桿菌產(chǎn)細菌素比較Table 8 Comparison of bacteriocins produced by different strains of L. plantarum

2.3 純化方案評價

2.3.1 蛋白質(zhì)含量的標準曲線

在595 nm波長下，吸光度A595nm與蛋白質(zhì)量濃度的回歸方程為y＝1.05x＋0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 9。式中：y為595 nm波長處的吸光度；x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）。

2.3.2 細菌素Nisin效價曲線

Nisin標準效價的對數(shù)值與抑菌圈直徑的回歸方程為y＝1.767 9x＋0.463，相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 8。式中：y為抑菌圈直徑（mm），x為效價的對數(shù)值。

2.3.3 植物乳桿菌產(chǎn)細菌素純化結(jié)果

如表9所示，最終細菌素的比活力為747.00 IU/mg，純化倍數(shù)為79.94 倍，回收率為1%。

表9 D1501酸漿中細菌素純化結(jié)果Table 9 Summary of purification of bacteriocin from soy whey fermented by L. plantarum D1501

2.4 細菌素Lp100的抑菌譜

表10 細菌素Lp100的抑菌譜Table 10 Antimicrobial spectrum of bacteriocin Lp100

如表10所示，與D1501酸漿對供試菌株的抑菌效果相類似，細菌素Lp100對親緣關(guān)系較近的乳酸菌具有抑制作用，而對細菌素產(chǎn)生菌植物乳桿菌D1501無抑制作用，表現(xiàn)出自身免疫性。同時，細菌素Lp100對供試的其他革蘭氏陽性菌和陰性菌都有較好的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜抑菌活性。值得指出的是細菌素Lp100對單核細胞性李斯特菌表現(xiàn)出特異的抑菌活性，具有II類細菌素的特性。但細菌素Lp100對供試的霉菌和酵母菌都不表達抑菌活性，而D1501酸漿對供試的假絲酵母有抑制作用，側(cè)面應(yīng)證D1501酸漿中可能還含有其他細菌素在表達抑菌活性。

3 討 論

D1501酸漿經(jīng)RESOURCE-Q陰離子交換層析、反相層析和二次反相層析得到的多個分離峰都能檢測出抑菌活性，推測D1501酸漿中可能含多種細菌素，且他們具有相似的離子性和疏水性。目前不乏存在產(chǎn)多種細菌素的植物乳桿菌的報道，與這一推論不謀而合。Diep[33]和Kleerebezem[34]等研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌C11能產(chǎn)生Plantaricin N、Plantaricin EF和Plantaricin JK 3 種細菌素。Ehrmann等[35]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌TMW1.25能產(chǎn)生細菌素Plantaricin W和Plantaricin 1.25β。Maldonado等[36]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌NC8能產(chǎn)生細菌素Plantaricin W和Plantaricin NC8。Yi Lanhua等[37]也研究發(fā)現(xiàn)棒狀乳桿菌XN8也能產(chǎn)生至少2 種細菌素。今后可以對其他具有抑菌活性的組分進行研究，以期分離出D1501酸漿中的多種細菌素，增加D1501酸漿的開發(fā)利用價值。

本研究細菌素的回收率僅有1%，在陰離子交換洗脫步驟中損失最多，分析原因可能是細菌素在不同pH值緩沖液中所帶電荷與電荷數(shù)量不同，部分細菌素可能未吸附在具高度選擇性的陰離子柱上，并且在洗脫過程中吸附上細菌素由于所帶電荷數(shù)量不同而分離成幾部分，而整個實驗只是選取抑菌活性最高的一部分細菌素用于下一步分離純化。今后應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化該細菌素的分離純化條件，以提高回收率，為該細菌素投入生產(chǎn)做準備。

4 結(jié) 論

研究表明，植物乳桿菌D1501發(fā)酵黃漿水所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是細菌素，并建立了超濾分離、RESOURCE-Q陰離子交換層析、反相層析、二次反相層析的分離純化體系，成功從D1501酸漿中分離純化出色譜純的小分子細菌素，并命名為Lp100。最終細菌素比活力達到7 247.00 IU/mg， 純化倍數(shù)為79.94 倍，回收率為1%。該細菌素分子質(zhì)量為1 434.90 Da，氨基酸序列為MCCKVLLLLSRR，屬于II類細菌素，并且具有廣譜抑菌活性。該細菌素的純化鑒定為深入研究其理化性質(zhì)并將其應(yīng)用于食品的保鮮防腐及利用酸漿產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)新型生物防腐劑提供理論依據(jù)，為實現(xiàn)黃漿水資源的綜合利用和保護環(huán)境提供新的可能。