王利樂，劉慶國，陳 勇,

(1.南京工業(yè)大學(xué) 國家生化工程技術(shù)中心，江蘇 南京 211800；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 211800)

能源是人類生產(chǎn)與生活的動力基礎(chǔ)，燃料乙醇作為一種清潔型燃料，已成為世界各國的可再生能源研究的熱點，也是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)で笸黄频闹攸c產(chǎn)品[1-4]。其中，生物法生產(chǎn)燃料乙醇的傳統(tǒng)菌株就是釀酒酵母[5]。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)技術(shù)采用游離細胞發(fā)酵，但此方法存在一系列缺點，而固定化技術(shù)具有一系列優(yōu)勢，如可以在較高的初始糖濃度下發(fā)酵，而且細胞在產(chǎn)生較高濃度乙醇的發(fā)酵液中仍可保持活性，并重復(fù)利用，展示出了更高的發(fā)酵效率[6-7]。這些優(yōu)點使得固定化發(fā)酵被應(yīng)用于酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這些優(yōu)勢主要得益于釀酒酵母細胞在固定化狀態(tài)下可以形成生物膜，這層生物膜賦予了細胞更強的抵抗發(fā)酵環(huán)境脅迫的能力，同時減少了發(fā)酵過程中的葡萄糖抑制作用。

生物膜是微生物的一種普遍的存在方式，因為微生物在多細胞群體下的生存能力會大大提高，所以微生物會自發(fā)地傾向于形成生物膜或者菌落[8]。超過80%的微生物能夠以一種膜樣生長的菌落形式存在，外表面被其自身分泌的富含多糖的細胞外多聚物覆蓋，這種菌群與胞外基質(zhì)組成的有機體稱為生物膜[9-10]。生物膜能夠形成在生物體或者非生物體的表面，呈膜樣生長，對抗菌因子及外界各種壓力有高度抗性。因此，生物膜在工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療方面均被廣泛關(guān)注。如白色念珠菌，在生物膜狀態(tài)下對抗生素的吸附能力增加4～5倍，所以對抗生素有極大的抗性，致病能力大幅提高[11]。細菌在生物膜狀態(tài)下，海綿狀的胞外基質(zhì)具有吸附/吸收作用，可以影響細胞與外界之間營養(yǎng)物質(zhì)、氣體及其他分子的交換，一些營養(yǎng)物質(zhì)可以保留在生物膜內(nèi)，使得膜內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的濃度較高，更有利于細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]。

生物膜由多種信號通路調(diào)節(jié)，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、蛋白質(zhì)激酶A(PKA)途徑，而且群體感應(yīng)也可能會調(diào)節(jié)生物膜的形成。MAPK途徑調(diào)節(jié)細胞類型的絲狀分化及生物膜的形成過程[13]，在該途徑激活狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子Tec1可以誘導(dǎo)黏附素基因(如flo11)的轉(zhuǎn)錄，其表達量是游離細胞的2倍[14]；tec1純合子敲除，膜形成能力嚴重減弱[15]。雷帕霉素作用靶標(TOR)信號途徑控制著營養(yǎng)吸收，可以通過Tor2激活葡聚糖合成酶調(diào)節(jié)因子Rho1[16]。Rho1通過調(diào)節(jié)MAPK途徑的組分Pkc1,從而控制細胞完整性[17-19]。Pkc1細胞完整性途徑已經(jīng)被證實參與葡聚糖合成酶fks1基因的表達[20]。而葡聚糖作為一種生物膜的組分，影響著細胞的生理特性。在釀酒酵母W303-1A的生物膜中，糖組分主要由葡萄糖、甘露糖及半乳糖組成[21]。在白色念珠菌中，β-1,3葡聚糖與藥物抗性有關(guān)，對于藥物敏感性起正向作用[10]。但是，不同酵母菌株間具有表型多樣性，生物膜成分、調(diào)節(jié)通路也可能有所差別[22]?；騠ks1編碼β-1,3-葡聚糖酶催化亞基，該基因的缺失會造成葡聚糖合成酶活性減弱以及葡聚糖合成量的降低。snf1基因的缺失會影響一系列葡聚糖合成相關(guān)的高爾基體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白以及細胞表面蛋白基因的表達[23]，并且當snf1缺失時，fks1、fks2表達量顯著降低[24]，同時侵入能力消失，成膜能力下降[25-26]，所以可以推斷生物膜的形成及其強度可能與葡聚糖合成相關(guān)。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，雙倍體釀酒酵母1308在成膜初期fks1基因表達異常，基于這一現(xiàn)象，筆者欲探索fks1基因是否會影響其成膜能力。

本研究基于同源重組原理，借助CRISPR技術(shù)的便利性[27]，通過一次轉(zhuǎn)化同時破壞雙倍體的等位基因fks1，通過分析敲除菌釀酒酵母1308生理生化特性嘗試探究fks1基因?qū)Τ赡さ挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒具體信息見表1。以釀酒酵母1308作為出發(fā)菌株菌，進行基因fks1的敲除。

表1 菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmid

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10。制備固體培養(yǎng)基時，添加20 g/L的瓊脂粉。用于釀酒酵母敲除后轉(zhuǎn)化子篩選時，添加終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素。

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 20、胰蛋白胨20、酵母粉10。根據(jù)培養(yǎng)的大腸桿菌需要，可加入50 μg/mL的卡那霉素、20 g/L的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖200、胰蛋白胨4、酵母膏4、KH2PO43、(NH4)2SO43、無水MgSO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。用于釀酒酵母發(fā)酵驗證實驗。

PLATE：40 mL PEG2000(50%)，5 mL醋酸鋰(1 mol/L)，5 mL TE Buffer(10×，100 mmol/L Tris-Cl，10 mmol/L EDTA，pH=8.0)。分別配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Primer STAR高保真聚合酶、酵母基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒，TaKaRa公司；DpnⅠ，NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；single stranded from salmon testes (ssDNA) ，Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 敲除菌的構(gòu)建

使用的引物由蘇州金唯智公司合成，具體序列見表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence

敲除菌株的構(gòu)建采用同源臂重組及CRISPR/Cas9敲除方法的聯(lián)合使用：采用一定長度的同源臂，可以極大提高外源片段在菌體內(nèi)的重組效率。首先在fks1基因上確定sgRNA位點，后設(shè)計引物fks1-pCAS-F2及fks1-pCAS-R2，并以質(zhì)粒pCAS為模板擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶切過夜后42 ℃、90 s熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落測序后獲得sgRNA與Cas9共表達質(zhì)粒pCAS-fks1。將釀酒酵母fks1基因sgRNA位點前后40 bp長的堿基序列作為敲除同源臂，連同質(zhì)粒上抗性基因片段前后各20 bp分別作為前后引物，即fks1-KAN-F2、fks1-KAN-R2，序列見表2，然后這對引物以pYX212-Aur質(zhì)粒為模板，擴增金擔(dān)子菌素基因片段作為敲片，膠回收純化備用。

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[27]，將轉(zhuǎn)化試劑及酵母感受態(tài)細胞配制成轉(zhuǎn)化態(tài)(表3)，30 ℃孵育30 min后在42 ℃熱激15 min，然后以10 000 r/min離心1 min，將細胞用250 μL YPD液體培養(yǎng)基重懸，涂布于質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素和400 μg/mL的遺傳霉素G418的雙抗性YPD平板，30 ℃培養(yǎng)36 h，以引物對fks1-F、fks1-R3進行菌落PCR驗證，即在含有體積為25 μL 0.02 mol/L NaOH的 EP 管中加入適量菌體，混勻，沸水浴 10 min后冰上放置10 min，以此作為PCR模板進行擴增。

表3 轉(zhuǎn)化體系Table 3 System of transformation

1.2.2 生長性能、菌株穩(wěn)定性與發(fā)酵性能分析

1)活化。將野生型釀酒酵母1308以及敲除菌△/△fks1-1308接種至裝有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)至OD600為1.0。

將活化的菌液以體積分數(shù)1%接種量接入裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)。每隔3 h取樣，根據(jù)測定的菌體濃度作釀酒酵母的生長曲線。

在無抗生素的YPD固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10個批次后，將菌體影印到含有0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素抗性的 YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng)1～3 d后，評估菌株生長狀況。

2)發(fā)酵。將3 g固定化材料放入250 mL三角燒瓶中滅菌，然后加入100 mL滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%的接種量接入活化的種子液，搖床在30 ℃、200 r/min條件下進行固定化發(fā)酵。

1.2.3 成膜能力表型分析

1)結(jié)晶紫染色。將OD600為0.1的野生型及敲除菌△/△fks1-1308釀酒酵母以10%的接種量接入新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)移至96孔板上，每孔200 μL，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h棄液體培養(yǎng)基，再加入200 μL的0.1%結(jié)晶紫，靜置染色 10～20 min，隨后用300 μL純水洗3遍，洗去浮色，晾干，拍照，最后加入200 μL冰醋酸，通過酶標儀在570 nm處測其OD570。

M為標準DNA；條帶1～10為挑選單菌落擴增結(jié)果；條帶0為原始菌擴增結(jié)果圖1 DNA凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of DNA

2)絮凝實驗。將活化后的菌液用水稀釋至OD600為1.0，取10 mL移至透明玻璃試管中靜置，分別于30、60和90 min時拍照，觀察其絮凝狀態(tài)。

3)成膜形態(tài)SEM電鏡。發(fā)酵結(jié)束后取固定化載體材料樣品，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗2遍，-80 ℃冷凍，真空冷凍干燥，然后噴金，通過TEM3000掃描電鏡(SEM)觀察材料表面生物膜形態(tài)。

1.2.4 胞外多糖分析

胞外多糖的制備及總組分測定。同一批發(fā)酵結(jié)束后得到的固定化載體，用純水沖洗兩遍后，加入0.1 mol/L的NaOH溶液，振蕩5 min溶解胞外基質(zhì)。之后5 000 r/min離心5 min，保留上清液，加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃過夜，5 000 r/min離心5 min，保留沉淀并干燥，即為釀酒酵母生物膜的胞外多糖。用純水將樣品制備成0.5 mg/mL的溶液，分別通過苯酚硫酸法、考馬斯亮藍、二苯胺法測定其總糖、蛋白質(zhì)、核酸含量[29]。

胞外多糖采用高效液相色譜分析。色譜條件：Aminex HPX-87X Column，流動相為5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，示差折光檢測器檢測，進樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 敲除菌的構(gòu)建與篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、敲除菌的篩選與鑒定

以fks1-pCAS-F2和 fks1-pCAS-R2為上下游引物，以質(zhì)粒pCAS為模板，PCR擴增后熱激法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)中，然后涂布于質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板表面，生長12～20 h，挑取單克隆于卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL、體積為5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒，進行DNA凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1。將陽性克隆的質(zhì)粒樣品送蘇州金唯智公司測序，確定質(zhì)粒序列，成功將20 bp靶位點替換，即成功構(gòu)建pCAS-fks1質(zhì)粒(圖1(a))。

以實驗室構(gòu)建并保存的pYX212-Aur質(zhì)粒為模板，以fks1-KAN-F2和fks1-KAN-R2為上下游引物，擴增帶有fks1基因40 bp同源臂的金擔(dān)子菌素抗性片段，約2 000 bp(圖1(b))，與理論大小一致，說明成功敲除了相關(guān)的基因片斷。

通過CRISPR二合一表達質(zhì)粒以及敲片的聯(lián)合使用，借助醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pCAS-fks1質(zhì)粒與敲片同時導(dǎo)入野生型釀酒酵母1308中，通過Cas9蛋白在等位基因上同時造成切口，同源臂可與目的基因發(fā)生同源重組，即可實現(xiàn)雙倍體的同時插入突變，然后涂布于抗性平板初步篩選轉(zhuǎn)化子。最后通過在插入位點前后設(shè)計的引物進行轉(zhuǎn)化子篩選，若雙倍體插入成功，使用驗證引物fks1-F、fks1-R3進行菌落PCR時，可以擴增出一條比原始菌目的片段大2 000 bp左右的單一條帶。最終成功篩選出fks1基因雙倍體敲除菌(圖1(c))，其中條帶0為以原始菌為模板的對照條帶，條帶3、4代表的菌株為單倍體敲除菌，條帶1、2、6、7、8、10代表的菌株為雙倍體敲除菌，從圖1結(jié)果來看，該方法獲得目的雙倍體敲出菌株的概率為60%，表明該方法效率較高。保藏雙倍體敲除菌株并命名為△/△fks1-1308。

2.1.2 遺傳穩(wěn)定性

將轉(zhuǎn)化子挑選出來，在無抗生素的YPD平板上連續(xù)劃線連續(xù)傳代10次后，劃線轉(zhuǎn)移至添加0.1 μg/mL金擔(dān)子菌素的YPD平板上可以正常生長，表明敲除菌性狀穩(wěn)定，未出現(xiàn)退化，為后續(xù)實驗分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2 敲除菌的生理生化性能分析

2.2.1 生長曲線

測定原始菌及敲除菌的生長曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，fks1基因插入失活使其活力降低，生長速度減慢。經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵及連續(xù)平板傳代之后，敲除菌菌落PCR結(jié)果顯示其抗性基因依然存在并且可以在抗性平板上正常生長，證明該菌株性能穩(wěn)定。但是，基因缺失使其生長速度略微下降，原始菌的最大菌體濃度出現(xiàn)在第30 小時左右，但是敲除菌的最大菌體濃度直到第36 小時才出現(xiàn)，表明該基因缺失妨礙了菌體的正常生長。之前Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，當fks1單倍體基因缺失后，會伴隨著生長速率減慢的現(xiàn)象，這與本研究的結(jié)果一致；而釀酒酵母BY4742 菌株fks1基因缺失后的生長速率正常，啤酒酵母工程菌G-03/C生長先慢后快，然后在穩(wěn)定期時菌體濃度和原菌相差無幾[32]。這結(jié)果表明基因fks1對不同釀酒酵母菌株的影響并不完全一致。

圖2 不同菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of different strains

2.2.2 敲除菌結(jié)晶紫染色及絮凝實驗

關(guān)于fks1基因缺失后的細胞抗逆性能力已有研究，如Wang等[30]證明在一定濃度的NaCl、乙醇、米卡芬凈等壓力環(huán)境中，fks1基因缺失會造成生長能力的減弱。微生物在聚苯乙烯表面吸附并形成菌落聚集體被認為是形成生物膜的表現(xiàn)之一，結(jié)晶紫染色后則可以直觀地表現(xiàn)出在聚苯乙烯表面吸附菌體的數(shù)量，結(jié)晶紫染色越深，表明菌體量越多。將fks1與成膜能力聯(lián)系起來，并通過結(jié)晶紫染色與絮凝實驗這兩個常用的試驗方法表征成膜能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知：敲除菌在96孔板上的著色效果明顯強于原始菌；結(jié)晶紫染色的吸光度數(shù)值越大，聚苯乙烯表面吸附菌體的數(shù)量越多，敲除菌的OD600遠大于原始菌，表明敲除菌吸附在聚苯乙烯表面的菌體數(shù)量比原始菌多；另外，根據(jù)絮凝實驗結(jié)果可以看出，敲除菌的絮凝速度略快于原始菌。由此可見，敲除菌在聚苯乙烯表面的成膜能力及絮凝能力均有所增強，反映了其成膜能力的增強。

2.2.3 平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴散生長試驗

成膜能力同樣也可以通過在固體及半固體培養(yǎng)基上的侵入及擴散效果來表征，平板沖洗實驗可以表征菌體侵入能力，是在臨床醫(yī)學(xué)方面研究生物膜特性最常用的分析手段之一，菌體在平板上的殘留量越多，表示侵入能力越強。因此考察平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴散生長試驗，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：在2%的瓊脂糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)單菌落2 d后，敲除菌的菌落較小，所以擴散能力弱于原始菌，但其侵入能力卻大大增強，表現(xiàn)為菌落深入固體培養(yǎng)基并持續(xù)生長；在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7～14 d，觀察到敲除菌較原始菌的擴散能力稍弱，表現(xiàn)為菌落表面積較小，這可能與其生長速度較慢有關(guān)。但Hope等[22]通過觀察多種酵母菌株生物膜相關(guān)表型，在統(tǒng)計學(xué)上表明雙倍體的侵入能力與聚苯乙烯吸附能力只有弱相關(guān)性，說明僅僅通過表型來驗證成膜能力是不充分的。因此有必要從固定化發(fā)酵實驗來探究生物膜的變化。

圖4 平板沖洗及半固體培養(yǎng)基浮游擴散生長試驗Fig.4 Plate wash and semi-solid medium expansion growth test

2.2.4 固定化發(fā)酵及材料表面的成膜狀態(tài)

將敲除菌和原始菌進行了一個批次的固定化發(fā)酵實驗，結(jié)果見圖5。由圖5可知：敲除菌和原始菌的葡萄糖消耗速率分別為(5.36±0.02)、(4.46±0.01) g/(L·h)，乙醇生成速率分別為(2.39±0.01)、(2.02±0.01) g/(L·h)，表明fks1基因缺失后，耗糖速率降低，與之前生長曲線圖譜的結(jié)果相吻合，生長速度慢、耗糖速率低導(dǎo)致了乙醇生成速率隨之降低；兩株菌的乙醇得率分別為0.44±0.01、0.45±0.01，兩者產(chǎn)量基本相同，說明fks1基因?qū)σ掖籍a(chǎn)量并未造成顯著影響。同時，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液樣品測其游離菌體量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除菌游離菌體遠遠少于原始菌，可以側(cè)面反映出敲除菌固定化在載體上的菌體數(shù)量遠多于原始菌。但是由于基因缺失后，乙醇產(chǎn)率的降低在工業(yè)化生產(chǎn)中非常不利，所以對于該基因缺失后如何彌補其帶來的生長缺陷仍值得進一步探究。

圖5 固定化發(fā)酵數(shù)據(jù)及固定化載體掃描電鏡圖Fig.5 Fermentation results and SEM images of immobilization carrier

將固定化發(fā)酵結(jié)束后的載體保留并取樣，取部分材料作為樣品，在TEM3000掃描電鏡下觀察其形態(tài)差異，可以發(fā)現(xiàn)，敲除菌在載體上的附著效果強于原始菌，表現(xiàn)為材料表面黏附的菌體數(shù)量增多且胞外分泌物變得清晰可見，成膜效果更明顯。綜上所述，敲除菌在固定化材料上的成膜效果強于原始菌。

2.3 胞外多糖的組分測定及高效液相色譜分析

苯酚硫酸法測定胞外多糖中總糖比例，敲除菌和原始菌分別為7.97%、4.89%；通過考馬斯亮藍測蛋白，比例分別為2.57%、3.81%，二苯胺法基本無法檢測到核酸存在，證明采用的胞外多糖的制備方法比較可靠。但是作為主要成分的多糖含量明顯偏低，主要成分仍未知，Al-Fattani等[33]證明胞外基質(zhì)組分中含有糖醛酸等成分，故對其組分進一步探究。

通過三氟乙酸水解，將糖的多聚物分解為單糖分子，使糖組分及糖醛酸組分通過高效液相色譜可以被檢測，結(jié)果見表4。由表4可知，胞外基質(zhì)主要組成成分為半乳糖醛酸，同時含有葡萄糖、甘露糖，其比例分別為88∶ 9∶ 3、92∶ 4∶ 4。其中，fks1基因缺失后，葡萄糖在胞外多糖中的比例明顯降低，甘露糖含量略微上升。fks1基因缺失后，對細胞壁的結(jié)構(gòu)和功能造成了影響，進而影響了其通透性及有關(guān)葡聚糖及甘露聚糖相關(guān)合成基因，這是造成胞外多糖成分變化的原因。

表4 胞外多糖組分檢測Table 4 Analysis of extracellular polysaccharide component

3 結(jié)論

通過構(gòu)建fks1基因雙倍體敲除菌，發(fā)現(xiàn)敲除菌侵入、黏附等成膜表征能力增強，借助SEM直觀地觀察到敲除菌在載體上胞外分泌物的增多，表明成膜能力提高。初步分析了胞外多糖的單糖組成成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了半乳糖醛酸、葡萄糖和甘露糖的存在。當fks1基因缺失后，生物膜中葡萄糖組分的比例明顯減小，同時，甘露糖含量增多，推測葡萄糖比例減少、甘露糖比例增多可能是生物膜增強的原因之一。因為甘露糖分子總是以甘露聚糖或者甘露糖蛋白的形式存在，所以猜測在釀酒酵母成膜這一過程中，甘露糖或者甘露聚糖有助于釀酒酵母1308成膜。此前，對于釀酒酵母fks1基因的研究主要聚集在對酵母細胞壁及自溶性能等方面，或是白色念珠菌的藥物互作，本研究將fks1基因直接與生物膜相聯(lián)系，并證明了有相關(guān)性，即首次揭示了fks1基因的缺失會影響釀酒酵母1308的成膜能力，但生物膜成膜機制十分復(fù)雜，仍需進一步研究探索。