於瑞梅，辛 瑜，顧正華，吳 松，李由然，丁重陽，石貴陽，張 梁

(1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.蘇州鯤鵬生物技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215300)

羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB,EC 3.4.17.2)是一類含有鋅離子的外肽酶，分子量為3.5×104，能夠特異性地切除蛋白質(zhì)或多肽C末端的堿性氨基酸，尤其是精氨酸和賴氨酸[1]。羧肽酶原B(proCPB)是羧肽酶B的酶原形式，胰蛋白酶通過在Arg95處切除前導肽可將羧肽酶原B激活，得到有活性的羧肽酶B[2]。羧肽酶B作為一個工具酶，在生物學、醫(yī)學診斷和藥物生產(chǎn)中有著重要的作用，已廣泛應用于蛋白質(zhì)、多肽的末端修飾[3]，急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清標記[4-6]，尤其在胰島素原活化為胰島素的過程中，羧肽酶B是不可缺少的雙酶之一[7]。此外，羧肽酶B的表達水平與一些疾病有關(guān)[8-9]。

早期常從胰腺組織中直接提取CPB，獲得的CPB不僅產(chǎn)量低、成本高，而且還可能混有感染物質(zhì)或其他蛋白酶[10]?；蚬こ炭梢杂行У亟鉀Q上述問題。CPB作為一種蛋白水解酶，對表達宿主存在蛋白毒性，而且在沒有前導肽輔助的情況下正確折疊率低，因此常以proCPB的形式進行重組表達。Eaton等[11]和Ventura等[12]在巴斯德畢赤酵母中分別表達了人血漿羧肽酶原B和豬胰腺羧肽酶原B；王德解[13]在畢赤酵母中利用pAOX1系統(tǒng)表達了鼠羧肽酶原B，比酶活可達110 U/mg；汪海洋[14]在粟酒裂殖酵母中表達了人源羧肽酶B，但表達量和酶活均很低。

除了在真核系統(tǒng)中進行異源表達，也有研究利用大腸桿菌進行原核表達。Li等[15]在大腸桿菌中以包涵體形式表達了大鼠proCPB；辛愛潔等[16]、張曉彥等[17]對鼠羧肽酶原B包涵體的變復性條件進行了研究；張映新等[18]在Li等[15]的研究基礎(chǔ)上對誘導條件進行優(yōu)化，首次實現(xiàn)了鼠羧肽酶原B在大腸桿菌中的可溶性表達。

總體來說，羧肽酶原B在大腸桿菌中的表達大多以包涵體形式存在，需經(jīng)過變性、復性步驟才能得到有活性的CPB。為了簡化純化步驟，節(jié)約生產(chǎn)成本，本研究中筆者在鼠羧肽酶原B的N端添加信號肽OmpA，以實現(xiàn)鼠羧肽酶原B在大腸桿菌中的胞外分泌表達，并進一步通過單因素和正交試驗對培養(yǎng)基組成(碳源、氮源、金屬離子與培養(yǎng)基添加劑)及發(fā)酵條件(誘導溫度與誘導時間)進行優(yōu)化，以期提高CPB的可溶性表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21(DE3)、表達載體pET-28a(+)保藏于筆者所在實驗室。

馬尿酰-L-精氨酸(hippuryl-L-arginine)，美國Sigma公司；一抗CPB(D-3)，圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司；二抗goat-anti-mouse IgG-HRP，愛必信(上海)生物科技有限公司；T4DNA連接酶，TaKara公司；蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，LB固體培養(yǎng)基另加入質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min。在質(zhì)粒構(gòu)建、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中添加的氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.2 儀器與設備

BoltTMMini Gel Tank、iBlot?2 Gel Transfer Device、iBindTMWestern Device，美國Thermo Fisher Scientific公司；SCG蛋白純化系統(tǒng)，蘇州賽譜儀器有限公司；S100D型PCR儀，美國Bio-Rad公司；CF16RX Ⅱ型冷凍離心機，日本HITACHI公司；V-1200型分光光度計，上海美譜達儀器公司；HYL-C型組合式搖床，太倉市實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

NCBI中查詢得到鼠源proCPB的mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_012533.2)和信號肽OmpA氨基酸序列(GenBank登錄號:AAC74043.1，第1～21個氨基酸為信號肽OmpA序列)，送往生工生物工程(上海)有限公司合成。分別以合成的信號肽OmpA和proCPB的cDNA為模板，proCPB-F/proCPB-R和OmpA-F/OmpA-R為引物(表1)進行PCR，得到片段OmpA和A-proCPB-6*His，二者進行融合PCR，獲得融合片段OmpA-proCPB-6*His。

表1 引物Table 1 Primers

將融合片段OmpA-proCPB-6*His通過T/A克隆連入pMD19-TSimple，獲得重組質(zhì)粒pMD19T-OmpA-proCPB，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到克隆宿主E.coliJM109中，菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并委托上海生工測序。用EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 對測序正確的重組質(zhì)粒進行雙酶切并膠回收融合片段，用T4DNA連接酶將融合片段與經(jīng)相同酶切后的載體pET28a連接，獲得重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB，并將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主E.coliBL21(DE3)中，菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒酶切驗證并測序。

1.3.2 種子培養(yǎng)

挑取甘油管保藏的重組表達菌株，在LB固體平板上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日，挑取長出的單菌落轉(zhuǎn)接至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h左右，作為種子液。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，然后加入終濃度為0.1 mmol/L的β-D-異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，置于20 ℃、200 r/min搖床中誘導培養(yǎng)30 h。

1.3.4 羧肽酶原B的純化

將誘導表達后的發(fā)酵液在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清粗酶液。用5 mL鎳柱對粗酶液進行純化。先用30 mL A液(25 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.4)平衡鎳柱，然后進樣120 mL，進樣時流速為1 mL/min，進樣結(jié)束后，先用50 mL A液進行柱沖洗，再用84%A液和16%B液(25 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L咪唑，pH 7.4)洗脫雜蛋白，最后以100%B液洗脫目的蛋白，收集蛋白峰洗脫液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。得到的上述proCPB洗脫液用含有0.5 mol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)進行透析，去除高濃度咪唑。

1.3.5 羧肽酶原B的酶解

胰蛋白酶通過在Arg95處切除前導肽可將羧肽酶原B激活，得到有活性的羧肽酶B。根據(jù)Bradford法[19]測定透析后proCPB酶液的蛋白濃度，并按照1∶ 50的質(zhì)量比向proCPB酶液中加入胰蛋白酶，37 ℃酶解2 h，每隔30 min取1次樣并做SDS-PAGE分析。

1.3.6 羧肽酶B的純化

酶解后得到的CPB酶液含有前導肽和胰蛋白酶，需再進行一次鎳柱純化。用1 mL鎳柱對酶解液進行純化。先用10 mL A液平衡鎳柱，然后進樣10 mL，進樣時流速為0.5 mL/min，進樣結(jié)束后，先用10 mL A液進行柱沖洗，再以100%B液洗脫目的蛋白，收集蛋白峰洗脫液，進行SDS-PAGE分析。得到的上述CPB洗脫液用25 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.1 mol/L NaCl，pH 7.65)進行透析，以去除高濃度的咪唑。

1.3.7 羧肽酶B的活力測定

羧肽酶B能夠?qū)ⅠR尿酰-L-精氨酸水解成馬尿酸，而馬尿酰-L-精氨酸和馬尿酸的吸收光譜具有差異。根據(jù)Folk等[20]的方法測定鼠羧肽酶B的活力：用25 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.1 mol/L NaCl，pH 7.65)配制的0.001 mol/L馬尿酰-L-精氨酸鹽溶液為底物(現(xiàn)配現(xiàn)用)，取光程為1 cm的帶蓋石英比色杯，加入25 ℃預熱過的3 mL底物溶液，并精密吸取重組CPB酶液10 μL加入，立即搖勻并調(diào)零，在254 nm的波長處每隔30 s讀取吸光度，共5 min。測定3次，取平均值。整個測定過程在室溫(25 ℃)進行。pH 7.65、25 ℃下每1 min水解1 μmol底物所需的酶量定義為1個酶活力單位U。

酶活力(U/mL)計算：以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標作圖，在吸光度對時間的關(guān)系圖中，取呈直線部分的吸光度，按式(1)計算。

(1)

式中：ΔA254/t(min)為相關(guān)系數(shù)R2>0.99時的回歸直線的斜率；0.36為在上述條件下，吸光度每分鐘改變0.36即相當于一個羧肽酶B單位；3為底物溶液體積，mL；0.01為加入的酶液體積，mL。

1.3.8 單因素試驗

選取碳源、氮源、金屬離子和培養(yǎng)基添加劑作為考察因素，通過測定proCPB胞外表達量和菌體生長量來判斷這些因素對產(chǎn)酶和菌體生長的影響，再通過單因素試驗的結(jié)果確定正交試驗的因素及水平。以下實驗每個因素做3個平行，取平均值。

1)不同碳源對proCPB產(chǎn)量及菌體生長的影響。以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加5 g/L的葡萄糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉、麥芽糖和蔗糖，以原始LB培養(yǎng)基作為對照，發(fā)酵結(jié)束后考察菌體量和proCPB的胞外表達量，篩選出最佳碳源。

2)不同氮源對proCPB產(chǎn)量及菌體生長的影響。在最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別用15 g/L的蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl和NaNO3來替代LB培養(yǎng)基中的復合氮源(質(zhì)量比2∶ 1的蛋白胨和酵母粉)，并以復合氮源作為對照，發(fā)酵結(jié)束后考察菌體量和proCPB的胞外表達量，篩選出最佳氮源。

3)不同金屬離子對proCPB產(chǎn)量及菌體生長的影響。在最佳碳源和最佳氮源的基礎(chǔ)上，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+，以不添加金屬離子作為對照，發(fā)酵結(jié)束后考察菌體量和proCPB的胞外表達量，篩選出最佳金屬離子。

4)不同培養(yǎng)基添加劑對proCPB產(chǎn)量及菌體生長的影響。在最佳碳源、最佳氮源和最佳金屬離子的基礎(chǔ)上，當添加誘導劑時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5 mol/L的山梨醇、質(zhì)量分數(shù)2%Tween-80、0.5%甘氨酸、1%甜菜堿、0.5%Triton X-100和0.02%SDS，以不添加培養(yǎng)基添加劑為對照，發(fā)酵結(jié)束后考察菌體量和proCPB的胞外表達量，篩選出最佳培養(yǎng)基添加劑。

1.3.9 正交試驗

以上述單因素試驗為基礎(chǔ)，結(jié)合誘導溫度和誘導時間進行6因素5水平的正交試驗，篩選出最佳的培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件，利用正交設計助手對結(jié)果進行分析。

1.3.10 Western blotting檢測胞外proCPB的表達量

取2 mL發(fā)酵液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，從中取出1.5 mL上清液，加入(NH4)2SO4至75%飽和度(0.387 g)進行沉淀，4 ℃過夜。次日，將(NH4)2SO4沉淀液在4 ℃下12 000 r/min離心20 min，吸盡液體并加入40 μL的8 mol/L尿素重懸底部蛋白沉淀，即為蛋白樣品。向蛋白樣品中加入10 μL的5×上樣緩沖液，混勻、煮沸并離心，然后點樣進行SDS-PAGE分析。按照操作說明書組裝NC膜、蛋白膠、濾紙等，并根據(jù)羧肽酶原B分子量大小(4.6×104)選擇合適的程序(P0)，用干轉(zhuǎn)儀將蛋白膠上的條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上。在室溫下，利用iBindTM全自動蛋白印跡處理系統(tǒng)實現(xiàn)相應一抗和二抗的孵育、洗膜。最后通過ECL化學發(fā)光法顯色，利用GelPro3軟件進行蛋白條帶灰度分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

M—標準DNA；1—重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA- proCPB經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切圖1 重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB雙酶切驗證Fig.1 Identification of pET28a-OmpA-proCPB by double restriction enzyme digestion

將構(gòu)建得到的重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB用EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗證，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,大小為5 724和1 313 bp的條帶，分別與pET28a線性化載體和OmpA-proCPB-6*His融合片段大小一致，且測序結(jié)果完全正確，說明重組表達質(zhì)粒pET28a-OmpA-proCPB構(gòu)建成功。

2.2 羧肽酶原B的分泌表達與純化

將重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB進行搖瓶發(fā)酵，誘導表達30 h后取發(fā)酵液進行離心，所得上清液即為粗酶液。經(jīng)鎳柱分離純化，并使用SDS-PAGE進行分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，條帶2為單一條帶，大小約為4.6×104，條帶大小與重組蛋白理論分子量一致，說明羧肽酶原B在信號肽OmpA的引導下成功分泌到胞外。文獻[21-22]報道，信號肽可以引導目的蛋白分泌到大腸桿菌胞外，常用的信號肽有OmpT、OmpA、PelB、PhoA和LamB等。越來越多的高效信號肽被研究者們挖掘出來，但目前并沒有一個信號肽可以適合各種目標蛋白，同一個信號肽的分泌效果也因目標蛋白而異。王德解[13]在畢赤酵母中利用pAOX1系統(tǒng)分泌表達了鼠羧肽酶原B，發(fā)酵過程中需補加甲醇，操作不方便，成本增加，生產(chǎn)周期長，但畢赤酵母系統(tǒng)可對表達的蛋白進行加工和修飾，外源蛋白分泌效率高，外源蛋白占總蛋白的10%～30%；大腸桿菌生長快、營養(yǎng)要求低、發(fā)酵周期短，但胞內(nèi)高表達易形成包涵體，本身分泌能力很弱，外源蛋白胞外表達只占0.3%～4%。

M—標準蛋白；1—重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA- proCPB發(fā)酵液上清液；2—純化后的proCPB圖2 重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA- proCPB 表達產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE analysis of expression products of recom- binant strain BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB

2.3 羧肽酶原B的酶解

根據(jù)proCPB酶液的蛋白濃度，按照1∶50的質(zhì)量比向透析后的proCPB酶液中加入胰蛋白酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中分別酶解0.5、1、1.5和2 h時取樣作SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，0.5 h時即有CPB條帶出現(xiàn)，但proCPB并沒有被酶解完全，隨著酶解時間的延長，proCPB條帶逐漸消失。直到2 h時，proCPB被全部酶解，酶解得到的CPB大小約為3.5×104，與理論的鼠羧肽酶B條帶大小一致。

羧肽酶原B是羧肽酶B的酶原形式，胰蛋白酶通過在Arg95處切除前導肽可將羧肽酶原B激活，得到有活性的羧肽酶B。胰蛋白酶的酶解條件對羧肽酶B的酶活性至關(guān)重要。筆者在1∶ 50質(zhì)量比的條件下，對胰蛋白酶的酶解時間進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)酶解時間過短，羧肽酶原B不能被完全酶解，只能得到部分羧肽酶B。有研究表明，酶解時間過長，則會將羧肽酶B也降解掉[23]，因此酶解時間的選擇至關(guān)重要。

M—標準蛋白；1—0.5 h；2—1 h；3—1.5 h；4—2 h圖3 胰蛋白酶最佳酶解時間的確定Fig.3 Determination of the optimum enzymatic hydrolysis time

2.4 羧肽酶B的純化及酶活力測定

透析后的proCPB酶液經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h后，立即加入0.1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應，并進行鎳柱分離純化，對洗脫液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，通過試驗得到單一目的條帶，大小約為3.5×104，經(jīng)測定比酶活為131.22 U/mg。王德解[13]在畢赤酵母中也表達了鼠羧肽酶原B，比酶活為110 U/mg，相同的基因，比酶活卻存在差異，這可能與酶的純度有關(guān)，筆者采用兩步鎳柱親和層析對產(chǎn)物進行純化，王德解[13]采用兩步疏水、兩步離子交換層析進行純化，純化方式不同，獲得的酶純度可能不同，因此比酶活也會存在差異。

M—標準蛋白；1—純化后的重組CPB圖4 純化后CPB的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of purified CPB

2.5 碳源對proCPB胞外表達量及菌體生長的影響

碳源對微生物生長代謝有著重要的作用，能夠提供細胞生長和合成產(chǎn)物的碳架以及細胞生命活動所需的能量。不同微生物所能產(chǎn)生的酶系不同，因而能夠利用的碳源也不同。考察6種碳源對重組大腸桿菌的生長及proCPB胞外表達量的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，以葡萄糖為碳源時，重組菌生長較差且目的蛋白proCPB幾乎未表達。一方面原因在于，proCPB由T7啟動子啟動表達，葡萄糖的存在會產(chǎn)生代謝物阻遏效應，抑制目的蛋白表達；另一方面可能是重組菌消耗葡萄糖后會產(chǎn)酸，使pH下降，不利于生長。以蔗糖為碳源時，重組菌的生長量與對照基本一致，但胞外proCPB的相對表達量只有0.31。重組菌對麥芽糖的利用程度較差，無法較好地生長。以可溶性淀粉為碳源時，重組菌的生長量有所提高，但胞外proCPB的相對表達量卻不足對照的一半。乳糖和甘油能夠明顯促進重組菌生長，但乳糖的產(chǎn)酶效果明顯比甘油差，原因可能是乳糖會加快誘導表達速度，使目的蛋白來不及正確折疊，形成包涵體，從而使胞外表達量減少。以甘油為碳源時，胞外proCPB的相對表達量達到2.09，甘油既有利于重組菌生長又利于產(chǎn)酶，因此選擇甘油為最佳碳源。

圖5 不同碳源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth and proCPB production

2.6 氮源對proCPB胞外表達量及菌體生長的影響

氮源主要用于菌體細胞物質(zhì)和含氮代謝物的合成。為了研究不同氮源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響，選取6種氮源進行單因素分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，分別以(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl和NaNO3為氮源時，重組菌的生長情況較差，影響到目的蛋白proCPB的胞外表達，一方面可能是無機氮源營養(yǎng)相對較少，另一方面可能是重組菌利用無機氮源后會使培養(yǎng)基的pH下降，不利于菌體生長，從而不利于產(chǎn)酶。以酵母粉或蛋白胨為單一有機氮源時，菌體生長量和胞外proCPB表達量都不如復合氮源(對照)，因此選擇復合氮源作為最佳氮源。

圖6 不同氮源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the growth and proCPB production

2.7 金屬離子對proCPB胞外表達量及菌體生長的影響

金屬離子在維持細胞生長和酶活性構(gòu)象方面具有重要作用，也是廣泛酶反應的必要組成部分。為了研究不同金屬離子對菌體生長和產(chǎn)酶的影響，分別向培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mmol/L的MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3、ZnSO4、NiSO4、CoSO4和CuSO4，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，羧肽酶B的活性中心含有Zn2+，但Zn2+的添加并沒有對菌體生長和proCPB的胞外表達起促進作用，反而產(chǎn)生了抑制，原因可能是雖然Zn2+能夠提高proCPB的酶活力，但過量的Zn2+對細胞生長代謝具有毒性作用。Ni2+、Co2+和Cu2+明顯抑制重組菌生長，Mg2+、Ca2+、Mn2+和Fe3+的添加對重組菌生長沒有較大的影響，但Mg2+卻能夠促進產(chǎn)酶，添加Mg2+時胞外proCPB的表達量是對照的1.45倍。Mg2+為微量元素，是許多酶的重要輔助因子，對菌體生長和產(chǎn)酶具有不可或缺的作用。圖7結(jié)果可知，Mg2+能夠促進目的蛋白proCPB的表達，這與張文超等[24]的研究結(jié)果吻合。因此，選擇Mg2+為最佳金屬離子。

圖7 不同金屬離子對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of different metal ions on the growth and proCPB production

2.8 培養(yǎng)基添加劑對proCPB胞外表達量及菌體生長的影響

培養(yǎng)基添加劑在一定程度上能夠改變細胞膜通透性從而促進目的蛋白的胞外分泌。已報道使用的培養(yǎng)基添加劑包括甘氨酸、Ca2+、有機溶劑(正戊醇，環(huán)己烷)、Tween-80、Tween-20、Triton X-100、SDS、Na+、Mg2 +、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、脯氨酸、甜菜堿、K-谷氨酸、蔗糖和山梨醇等[21]。因此選擇考察山梨醇、Tween-80、甘氨酸、甜菜堿、Triton X-100和SDS這6種物質(zhì)對proCPB胞外表達量及菌體生長的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，分別向培養(yǎng)基中添加Tween-80、甘氨酸、甜菜堿和Triton X-100，重組菌的生長量略低于對照，但胞外proCPB的表達量卻明顯比對照少。SDS的添加對重組菌生長造成了很大的負面影響，胞外幾乎沒有目的蛋白。山梨醇對胞外proCPB表達量的提高具有一定促進作用，添加山梨醇時胞外proCPB的表達量是對照的1.22倍。山梨醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，一方面能夠促進目的蛋白的可溶性表達[25]，另一方面能夠維持環(huán)境滲透壓穩(wěn)定，從而有利于目的蛋白的胞外分泌。栗亞美等[21]研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇對分泌表達具有明顯促進作用，它能夠提高外膜通透性，從而導致蛋白“滲漏”到培養(yǎng)基中。因此，選擇山梨醇為最佳培養(yǎng)基添加劑。

圖8 不同培養(yǎng)基添加劑對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of different medium additives on the growth and proCPB production

2.9 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對甘油、復合氮源、MgSO4、山梨醇、誘導溫度和誘導時間6個因素各設5個水平進行分析。以原始LB培養(yǎng)基為對照，胞外proCPB的相對表達量為評價指標，正交試驗結(jié)果與分析見表2和表3。由表2和表3可知，各因素對胞外proCPB表達量的影響從大到小為誘導時間、誘導溫度、復合氮源、MgSO4、山梨醇、甘油，說明誘導時間對實驗結(jié)果的影響最大，其次是誘導溫度和復合氮源，甘油對實驗結(jié)果的影響最小。由表3得出最佳組合為A3B3C5D2E4F1，即甘油7 g/L，復合氮源15 g/L、MgSO44 mmol/L、山梨醇0.3 mol/L、NaCl 10 g/L，誘導溫度30 ℃，誘導時間24 h。在此優(yōu)化條件下，胞外proCPB的相對表達量為6.35，是優(yōu)化前的6.35倍，OD600為8.58，是優(yōu)化前的2.64倍。

表2 正交試驗設計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

表3 正交試驗極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment results

3 結(jié)論

在信號肽OmpA的引導下，鼠羧肽酶原B直接分泌到培養(yǎng)基中，首次實現(xiàn)了鼠源羧肽酶原B在大腸桿菌中的胞外分泌表達。經(jīng)純化及胰蛋白酶激活，得到活性CPB，比酶活為131.22 U/mg。以原始LB培養(yǎng)基為對照，proCPB胞外表達量為指標，通過單因素試驗對培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，確定最佳碳源為甘油，最佳氮源為復合氮源，最佳金屬離子為Mg2+，最佳添加劑為山梨醇。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合誘導溫度和誘導時間進行六因素五水平的正交試驗，最終得出最佳培養(yǎng)基組合為甘油7 g/L，復合氮源15 g/L、MgSO44 mmol/L、山梨醇0.3 mol/L、NaCl 10 g/L，最佳發(fā)酵條件為誘導溫度30 ℃，誘導時間24 h。優(yōu)化后，胞外proCPB的相對表達量為6.35，是優(yōu)化前的6.35倍；OD600為8.58，是優(yōu)化前的2.64倍，優(yōu)化效果顯著。