周大袁，林佳輝，李 霜

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

表面活性素(surfactin)是芽孢桿菌(Bacillus)分泌的一種脂肽類化合物，由親水肽環(huán)與疏水脂肪酸鏈組成[1]。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，surfactin具有低毒、可生物降解、可再生、優(yōu)異的乳化活性與表面活性等優(yōu)點，在石油開采、環(huán)境修復(fù)、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[2-4]。

當前，采用誘變育種或培養(yǎng)基優(yōu)化等技術(shù)可將產(chǎn)surfactin野生菌株的產(chǎn)量從100～600 mg/L提高到1 000 mg/L左右[5-6]；采用基因工程手段，如改造surfactin合成模塊的啟動子強度和促進產(chǎn)物外排等，可將surfactin產(chǎn)量提升2～5倍[7-8]。在surfactin的發(fā)酵過程中，由于surfactin具有良好的表面活性和起泡性，在攪拌和曝氣過程中會形成大量的泡沫，泡沫攜帶大量發(fā)酵液及菌體從生物反應(yīng)器的排氣口溢出，造成產(chǎn)物、營養(yǎng)物質(zhì)和細胞的流失，并且伴隨著高度污染風險。近年來，泡沫分離裝置[9]、固定化發(fā)酵[10]以及厭氧發(fā)酵[11]等發(fā)酵裝置和工藝相繼出現(xiàn)，仍未有效解決產(chǎn)泡難題。

可溶性血紅蛋白(VHb)是透明顫菌屬(Vitreoscilla)菌株體內(nèi)的一種可以高效攝取環(huán)境中氧分子的蛋白，它可以提升細菌在發(fā)酵液中的攝氧量，因而在各種好氧微生物中得到應(yīng)用[12-13]。編碼VHb蛋白的基因是vgb，其啟動子Pvgb是溶氧調(diào)控型，可以在低氧含量的條件下被啟動，增加VHb的含量，從而增加細菌的攝氧率。Wu等[14]用串聯(lián)重復(fù)的Pvgb啟動子調(diào)控Escherichiacoli中聚羥基丁酸酯(PHB)關(guān)鍵基因的表達，使得重組E.coli在微氧發(fā)酵條件下PHB產(chǎn)量提高了3.5倍，達到4.86 g/L。而Pvgb啟動子在枯草芽孢桿菌中的活性及溶氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄強度等研究尚未有研究報道。

Surfactin是由非核糖體肽合成酶(NRPS)催化合成的模式化合物，NRPS負責識別和催化不同的氨基酸底物，進行surfactin的肽端模塊組裝，而4′-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(Sfp功能蛋白)則是起著“激活”NRPS中功能結(jié)構(gòu)域的作用[15]。因為Bacillussubtilis168菌株中編碼Sfp功能蛋白的基因sfp發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致它無法合成surfactin；將sfp基因回補到168菌株后，重組168菌株可以合成surfactin[16]。

本文中，筆者考察溶氧誘導(dǎo)型啟動子Pvgb及其串聯(lián)多拷貝啟動子在枯草芽孢桿菌168菌株中的轉(zhuǎn)錄水平，利用溶氧誘導(dǎo)型啟動子Pvgb調(diào)控Sfp蛋白的表達，考察不同溶氧條件下重組168菌株合成surfactin的能力，以期為微氧發(fā)酵surfactin工程菌的構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌B.subtilis168(簡稱Bs168)、surfactin高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌B.subtilisBS-37、大腸桿菌E.coliDH5α、質(zhì)粒載體pHY300PLK與帶有綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒(pJN-gfp)，保存于筆者所在實驗室；帶有8個串聯(lián)重復(fù)Pvgb啟動子質(zhì)粒(pBHR-P8vgb)由清華大學(xué)陳國強教授饋贈。

1.1.2 儀器設(shè)備

ZQZY-70BS型雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；DGP3600-SD型高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Spectra Max M3型多功能酶標儀，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.1.3 工具酶及試劑

限制性內(nèi)切酶(XbaⅠ、SmaⅠ)、PCR高保真酶Prime STAR Mix與質(zhì)粒T4連接酶，TaKaRa公司；引物合成及測序由蘇州金唯智公司完成；其余試劑為進口或國產(chǎn)市售分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌與芽孢桿菌均用LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 10.0、酵母粉 5.0、NaCl 10.0。培養(yǎng)基調(diào)pH為7.0，0.1 MPa滅菌20 min。

抗生素(μg/mL):氨芐青霉素50、四環(huán)素20。

產(chǎn)surfactin發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 20.0、蛋白胨 20.0、KH2PO410.0、K2HPO43.0、MgSO40.5、FeSO40.02。

種子培養(yǎng)液培養(yǎng)條件：37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h；發(fā)酵培養(yǎng)基接種量為2%(體積分數(shù))，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

不同溶氧控制方法：高溶氧培養(yǎng)條件是250 mL帶擋板的錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵液，8層紗布封口，轉(zhuǎn)速為200 r/min；低氧培養(yǎng)條件是250 mL錐形瓶中裝入100 mL發(fā)酵液，16層紗布封口，轉(zhuǎn)速為100 r/min。

1.1.5 引物

本實驗所用引物如表1所示。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.2 方法

1.2.1 不同基因片段的重疊PCR

重疊PCR分兩步進行。第一步：分別以Bs168、B.subtilisBS-37、pBHR-P8vgb和pNJ-gfp為模板，用表1中的引物，反應(yīng)體系為模板1 μL，上下游引物各1 μL，Prime STAR Mix 25 μL，重蒸水 22 μL。PCR條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸(每1 000 bp衍生1 min)，30個循環(huán)，PCR結(jié)束后進行膠回收。第二步：以膠回收好的基因片段為模板，反應(yīng)體系為需要重疊的2個片段各1 μL，2個片段的上下游引物各1 μL(需要重疊在一起的片段中，5′引物為上游引物，3′為下游引物)，Prime STAR Mix 25 μL，重蒸水 21 μL；PCR條件不變，結(jié)束后膠回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)過重疊PCR的基因產(chǎn)物與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHY300PLK，分別用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SmaⅠ酶切4 h后，經(jīng)過膠回收，再用T4連接酶過夜連接，獲得不同的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E.coliDH5α中，用四環(huán)素與氨芐青霉素抗性平板篩選，挑選單克隆，再經(jīng)菌落PCR驗證。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化方法參照文獻[17]進行，最后提取質(zhì)粒PCR驗證。

1.2.4 發(fā)酵液中surfactin含量測定

取發(fā)酵液1 mL，在12 000 r/min條件下離心5 min；取300 μL上清液，用1 200 μL色譜級無水乙醇稀釋混勻，12 000 r/min條件下離心5 min后，用0.22 μm的有機膜過濾，記為待測樣品。Surfactin的檢測利用高效液相色譜(戴安P680)，色譜柱為Amethyst C18-P column(4.6 mm×250 mm，5 μm)。液相條件為流動相為90% 的甲醇與10%的水(含有0.05%的三氟乙酸)，進樣量40 μL，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃;采用紫外檢測器檢測，波長為214 nm。以surfactin標準品(Sigma公司)為參照進行定量定性。

1.2.5 菌體熒光性檢測

取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min后，用無菌水懸浮清洗3次后，將菌體濃度稀釋成同一濃度，取200 μL待測菌液至96孔酶標板上，設(shè)置出發(fā)菌作為對照，用Spectra Max M3多功能酶標儀檢測，選擇激發(fā)濾光片為485 nm、發(fā)射濾光片為525 nm。用HT Soft軟件分析所得數(shù)據(jù)，并重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達質(zhì)粒pHY300-Pvgb-gfp、pHY300-P43-gfp構(gòu)建及驗證

以質(zhì)粒pJN-gfp為模板，用表1中的引物克隆出gfp基因，并與已獲得啟動子P43或單個Pvgb重疊PCR，獲得的克隆片段P43-gfp、Pvgb-gfp與質(zhì)粒pHY300都經(jīng)過XbaⅠ與SmaⅠ的限制性酶切后，用T4連接酶過夜連接，獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α中，挑取單菌落進行PCR驗證，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，酶切基因gfp片段長度約為727 bp，表明重組質(zhì)粒pHY300-Pvgb-gfp、pHY300-P43-gfp構(gòu)建成功。

1—P43 gfp驗證；2—P43驗證；3—Pvgb gfp驗證；M—DNA標準品圖1 重組質(zhì)粒pHY300-P43-gfp與pHY300- Pvgb-gfp的PCR驗證Fig.1 PCR profile of recombinant plasmid pHY300- P43-gfp and pHY300-Pvgb-gfp

2.2 多拷貝啟動子Pvgb及表達質(zhì)粒pHY300-Pnvgb-gfp構(gòu)建

Wu等[14]證明在大腸桿菌中Pvgb啟動子的轉(zhuǎn)錄強度受到其串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)量的影響，Pvgb啟動子拷貝數(shù)為1～8時，轉(zhuǎn)錄強度具有正相關(guān)性。但在枯草芽孢桿菌中，Pvgb啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及強度還未見報道，因此本實驗中使用綠色熒光蛋白GFP為標記蛋白，考察1～3個重疊啟動子Pvgb的啟動強度，構(gòu)建了1～3個重疊的Pvgb啟動子(圖2)，以gfp為報告基因，構(gòu)建表達質(zhì)粒pHY300-Pnvgb-gfp，并導(dǎo)入大腸桿菌E.coliDH5α中，挑取單菌落進行PCR驗證。

由圖2可知，PCR驗證結(jié)果出現(xiàn)明顯的兩條或三條帶，這是因為Pvgb啟動子重疊了2個或3個。由此可推斷重組質(zhì)粒pHY300-Pnvgb-gfp構(gòu)建成功。

M—DNA標準品；1—Pvgb驗證；2—Pvgb-gfp驗證；3—P2vgb驗證；4—P2vgb-gfp驗證；5—P3vgb驗證；6—P3vgb-gfp驗證圖2 重組質(zhì)粒pHY300-Pnvgb-gfp的PCR驗證Fig.2 Colony PCR profile of recombinant plasmid pHY300-Pnvgb-gfp

2.3 重組表達質(zhì)粒pHY300-Pvgb-sfp、pHY300-P43-sfp構(gòu)建及驗證

以Bs168為模板克隆P43啟動子序列，以高產(chǎn)surfactin菌株B.subtilisBS-37[10]為模板克隆具有功能的sfp基因，再以質(zhì)粒pBHR-P8vgb為模板，克隆出單個Pvgb啟動子，并用重疊PCR獲得Pvgb-sfp與P43-sfp片段。將獲得的克隆片段與質(zhì)粒pHY300經(jīng)過XbaⅠ與SmaⅠ的限制性酶切后，用T4連接酶連接過夜，獲得重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α中，挑取單菌落進行PCR驗證，結(jié)果如圖3所示。

M—DNA標準品；1—P43驗證；2—P43-sfp驗證；3—Pvgb驗證；4—Pvgb-sfp驗證圖3 重組質(zhì)粒pHY300-P43-sfp與pHY300- Pvgb-sfp的PCR驗證Fig.3 Colony PCR profile of recombinant plasmid pHY300-P43-sfp and pHY300-Pvgb-sfp

由圖3可知，啟動子P43長度是387 bp，基因sfp長度是675 bp，啟動子Pvgb長度是135 bp，表明重組質(zhì)粒pHY300-Pvgb-sfp、pHY300-P43-sfp構(gòu)建成功。

2.4 單個啟動子Pvgb與多拷貝啟動子Pvgb在枯草芽孢桿菌中啟動活性測定

利用GFP蛋白編碼基因為報告基因，考察單個啟動子(Pvgb)、2個啟動子(P2vgb)以及3個啟動子串聯(lián)(P3vgb)在Bs168中的表達水平，結(jié)果如圖4所示。

培養(yǎng)條件：1—50 mL發(fā)酵液(250 mL搖瓶)，8層紗布，37 ℃、200 r/min；*—100 mL發(fā)酵液(250 mL搖瓶)，16層紗布，37 ℃、100 r/min圖4 不同溶氧條件下不同啟動子的熒光強度比較Fig.4 Comparison of fluorescence intensities of different promoters under different dissolved oxygen conditions

由圖4可知，隨著Pvgb拷貝數(shù)增加，GFP的表達水平有一定增強，P3vgb啟動的表達量可以提高1倍，這也與Wu等[14]在大腸桿菌中的研究結(jié)果相同；但溶氧水平對單個和多拷貝的Pvgb啟動子的表達水平?jīng)]有特別顯著的影響，在低溶氧水平下，P3vgb的表達量僅比高溶氧水平的對照組提高了不到20%。同時，與枯草芽孢桿菌中常用的強啟動子P43相比，單個及多拷貝Pvgb的表達強度遠遠低于前者，表明在枯草芽孢桿菌中Pvgb具有一定的啟動活性，但強度很低。

2.5 重組菌株的surfactin發(fā)酵結(jié)果

2.5.1 重組菌株B.subtilis168-P43-sfp與B.subtilis168-Pvgb-sfp的surfactin發(fā)酵驗證

宿主Bs168菌株因sfp基因的移碼突變，無法合成surfactin，將具有活性功能的sfp基因構(gòu)建到重組質(zhì)粒pHY300-P43-sfp和pHY300-Pvgb-sfp中，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入宿主Bs168中，獲得了重組菌株Bs168-P43-sfp與Bs168-Pvgb-sfp，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，重組枯草芽孢桿菌在LB培養(yǎng)基中好氧發(fā)酵24 h后，用高效液相色譜(HPLC)檢測surfactin的產(chǎn)量(結(jié)果證明野生菌株Bs168無法合成surfactin)，而導(dǎo)入有活性的Sfp蛋白后，重組Bs168菌株可以生產(chǎn)surfactin，與Ongena等[18]研究結(jié)果相同。

圖5 Surfactin的高效液相色譜Fig.5 HPLC chromatography of surfactin

利用168菌株構(gòu)建產(chǎn)surfactin工程菌，可以選用不同來源的Sfp功能蛋白。將本研究中所表達的Sfp功能蛋白與劉麗霞等[16]所使用的Sfp功能蛋白比較后發(fā)現(xiàn)，其同源性為72%，表明Bs168菌株的NRPS系統(tǒng)對Sfp功能蛋白具有較好的適配性。

2.5.2 重組菌株在不同溶氧條件下的surfactin發(fā)酵

將攜帶P43-sfp以及不同拷貝Pnvgb-sfp(n=1～3)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Bs168菌株中，考察4個重組菌株在不同溶氧條件下的surfactin發(fā)酵水平，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同發(fā)酵條件下重組菌株Bs168的surfactin產(chǎn)量Fig.6 Surfactin yield of recombinant Bs168 strains under different fermentation conditions

由圖6可知：不同溶氧條件下重組菌株的surfactin產(chǎn)量差異巨大，在高氧條件下，4個重組菌株的surfactin產(chǎn)量差異不顯著，均可以達到1 800 mg/L，單位菌體密度(1 OD)的生產(chǎn)水平為380 mg；但在低氧條件下，surfactin產(chǎn)量均只有200 mg/L，單位菌體密度的生產(chǎn)水平為80 mg。

上述結(jié)果表明：Sfp功能蛋白的表達水平并不是決定surfactin合成能力的關(guān)鍵因素，高溶氧條件才是surfactin高效合成的重要因素；即使細胞中Sfp功能蛋白的數(shù)量差異達百倍，對surfactin的合成能力并無顯著影響。影響surfactin合成的因素包括srfA的表達水平[7]以及合成前體如中長鏈β-羥基酯酰CoA和重要氨基酸前體(如，L-Leu、L-Glu和L-Asp等)的供給水平[19]。王大威等[20]在產(chǎn)脂肽的枯草芽孢桿菌ZW-3中表達了透明顫菌血紅蛋白基因VHb，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肽產(chǎn)量提高了31.8%，達111.6 mg/L。用于合成surfactin的NRPS是一個多酶復(fù)合物，由srfA基因簇上的4個基因(srfAA、srfAB、srfAC和srfAD)編碼，在Bs168菌株中srfA基因簇的啟動子PsrfA是一個誘導(dǎo)型強啟動子[20]。因此，進一步強化Bs168菌株在低溶氧下合成surfactin的能力需要從兩個方面開展：①提高細胞的溶解氧攝取能力和強化低溶氧下srfA的表達水平；②在surfactin生產(chǎn)菌株中進行外源VHb基因的強化表達將有助于提高菌株對溶解氧的攝取能力，提升菌株在低溶氧條件下的surfactin發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

將來源于透明顫菌血紅蛋白VHb的溶氧調(diào)控型啟動子Pvgb在枯草芽孢桿菌168菌株中進行了功能驗證，發(fā)現(xiàn)Pvgb在168菌株中為弱啟動子，具有較弱的低溶氧誘導(dǎo)作用和“劑量效應(yīng)”。通過比較弱啟動子Pvgb與強啟動子P43對Sfp功能蛋白的表達以及溶氧水平對surfactin發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168菌株中決定surfactin合成能力的關(guān)鍵因素是溶氧水平而不是Sfp功能蛋白的表達量。因此，強化表達提高溶氧攝取能力的VHb功能基因?qū)⒂兄诖龠M菌株在低溶氧水平下的surfactin合成能力。