金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉啟超 唐一通 劉雪妮 王夢(mèng)曉 傅琴琴 肖娜

[摘 要]金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院感染和食物中毒的重要病原菌，建立和發(fā)展快速檢測(cè)方法對(duì)于該菌的診斷和防控具有重要意義。該文對(duì)基于免疫磁珠分離技術(shù)開(kāi)展金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的方法進(jìn)行了探究，是今后開(kāi)展病原菌檢測(cè)的發(fā)展方向。

[關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌;免疫磁珠;快速檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R155.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-9324（2020）47-0-03[收稿日期] 2020-05-31

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）廣泛分布于人的體表、上呼吸道等部位，是最常見(jiàn)的人體致病菌之一，其既可引起院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染，也是重要的食源性感染的病原菌[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的出現(xiàn)和迅速傳播，使得金黃色葡萄球菌的感染變得越來(lái)越難以治療，已成為抗感染治療的一大難題[2]。

目前，有多種基于細(xì)菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及生物傳感器等原理的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法。隨著免疫磁性微球技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，基于免疫磁珠技術(shù)的病原菌快速檢測(cè)技術(shù)得到快速發(fā)展。免疫磁性分離技術(shù)是通過(guò)將抗原抗體等識(shí)別物包被在具有一定粒徑范圍的超順磁性納米磁珠上，利用磁珠的磁響應(yīng)性對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集分離的技術(shù)。因該技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速，特異性和靈敏度高，近些年在蛋白、核酸純化，細(xì)胞分離以及病原菌檢驗(yàn)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。本文總結(jié)了基于免疫磁分離技術(shù)開(kāi)展金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的方法。

一、免疫磁珠直接富集分離法

周莉等[3]利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體對(duì)食品樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行富集分離，具有較好的特異性和靈敏度。敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)免疫磁性微球富集和平板培養(yǎng)，可從細(xì)菌濃度為14cfu/mL的培養(yǎng)液中檢出金黃色葡萄球菌，靈敏度遠(yuǎn)高于直接涂板計(jì)數(shù)方法。該方法可用于牛奶、醬油和速凍水餃等樣品中金葡菌的微量檢測(cè)。吳俊等[4]利用直徑20nm的裸磁珠對(duì)培養(yǎng)液中的金黃色葡萄球菌具有較好的吸附能力，對(duì)濃度為102～107cfu/mL的培養(yǎng)液中的細(xì)菌吸附率可達(dá)95%以上，最大吸附量為6×108cfu/mg。磁珠吸附富集的菌體提取DNA，可滿足熒光PCR測(cè)定需要。

黃煥宜[5]等將鼠抗金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)至Fe3O4納米磁性微球上制備免疫磁性微球，對(duì)金黃色葡萄球菌具有較高的捕獲能力，當(dāng)菌液濃度為103cfu/mL時(shí)，捕獲能力可達(dá)73%，捕獲能力隨著菌液濃度的增高而下降。王程程等[6]利用鏈霉親和素磁珠和生物素化兔抗金葡菌多克隆抗體制備免疫磁珠，用其分離食品中的金黃色葡萄球菌，捕獲靈敏度可達(dá)10cfu/mL，用時(shí)小于1h，可用于對(duì)食源性金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。

二、免疫磁珠—多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Multiple Polymerase Chain Reaction，MPCR）

周麗珍等[7]利用親和素標(biāo)記的磁珠和生物素標(biāo)記的spa單克隆抗體制備免疫磁珠從痰液中富集金黃色葡萄球菌，再聯(lián)合多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multiple polymerase chain reaction，MPCR）檢測(cè)痰液樣本中MRSA菌株mecA基因和femA基因，進(jìn)行MRSA菌株的檢測(cè)。與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)+Vitek-2全自動(dòng)微生物分析儀相比，在檢出率、敏感性和特異性等方面均有優(yōu)勢(shì)，尤其是可將檢測(cè)時(shí)間有原來(lái)的48～72h，縮短至4～6h。該方法可以對(duì)臨床患者痰液樣本中的MRSA進(jìn)行敏感、特異、快速的檢測(cè)，有助于MRSA菌株的診斷與控制。

三、免疫磁珠富集—PCR法

鄧奕等[8]將金黃色葡萄球菌多抗偶聯(lián)于500nm超順磁性微球制備免疫磁性微球，聯(lián)合PCR方法檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。建立方法具有較高檢測(cè)特異性和靈敏度，不需增菌培養(yǎng)，檢測(cè)靈敏度為104cfu/mL。高濤[9]等利用免疫磁珠—實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)586份各類食品樣品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌3種致病菌進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法比較，兩種方法符合率為93.22%，而且新方法可在2h～3h內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，是一種可推廣應(yīng)用于食源性微生物檢測(cè)的方法，也可以應(yīng)用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測(cè)。

馬凱等[10]利用超順磁性納米微球和金黃色葡萄球菌、志賀氏菌多克隆抗體制備免疫磁珠，從豬鮮肉中捕獲兩種病原菌，提取核酸后，使用兩重?zé)晒舛縋CR法進(jìn)行快速核酸檢測(cè)，對(duì)兩種細(xì)菌的檢測(cè)限可達(dá)2.52cfu/g和1.36cfu/g，是一種可以快速進(jìn)行食源性金黃色葡萄球菌和志賀菌檢測(cè)的方法。

四、免疫磁珠—ATP發(fā)光檢測(cè)技術(shù)

ATP發(fā)光檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)便快速和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，但是該技術(shù)靈敏度較低，最低檢測(cè)限為103個(gè)細(xì)菌/mL，不符合衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)要求。但將該技術(shù)與免疫磁珠分離技術(shù)相結(jié)合，則在微生物檢測(cè)、細(xì)胞分離等領(lǐng)域有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用?？軙跃У萚11]將免疫磁珠和ATP生物發(fā)光技術(shù)聯(lián)合，建立了一種快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等食品中常見(jiàn)致病菌的新方法，能夠大大降低檢測(cè)限，檢測(cè)靈敏度可達(dá)102cfu/mL。

五、免疫磁珠—重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）

重組酶聚合酶擴(kuò)增是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的一種，相較傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，具有較高的靈敏性，而且能夠在簡(jiǎn)便而無(wú)須昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件下開(kāi)展應(yīng)用，能夠在基層開(kāi)展應(yīng)用。近年來(lái)在食源性病原微生物檢測(cè)及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域得到快速發(fā)展。王亞磊[12]將制備的金黃色葡萄球菌單克隆抗體與直徑為750nm的羧基磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠，用于捕獲樣品中的金黃色葡萄球菌，有較好的捕獲率和特異性，捕獲靈敏度可達(dá)102cfu。同時(shí)，針對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因設(shè)計(jì)RPA引物并進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化后，利用免疫磁珠-RPA-LF技術(shù)對(duì)金葡菌基因組的最低檢測(cè)靈敏度可達(dá)600fg。通過(guò)對(duì)牛奶樣品中金葡菌的檢測(cè)顯示，當(dāng)樣品中金葡菌濃度低至7.5×102cfu/mL時(shí)，亦可檢出陽(yáng)性結(jié)果。

六、免疫磁珠—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NotomiT等[13]在2000年開(kāi)發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是選取檢測(cè)目的基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4—6條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)比較，無(wú)須溫度循環(huán)過(guò)程，避免了對(duì)溫度循環(huán)和PCR儀器設(shè)備的需求，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。在病原菌檢測(cè)、臨床診斷、環(huán)境和食源安全檢測(cè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

呂觀等[14]將免疫磁珠和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，將生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)于鏈酶親和素磁珠上制備免疫磁珠，每毫克磁珠與6?L金黃色葡萄球菌抗體結(jié)合，對(duì)104cfu/mL金黃色葡萄球的捕獲效率可達(dá)56.80%。用建立的免疫磁珠-LAMP方法，針對(duì)nuc基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，對(duì)牛肉中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)4.4cfu/mL，可以有效地從牛肉中檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

許會(huì)會(huì)[15]將制備的金葡菌多抗包被至二氧化硅磁珠表面制備免疫磁性微球，對(duì)牛奶中金葡菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.81×102cfu/mL。結(jié)合LAMP方法，檢測(cè)金葡菌nuc基因，對(duì)采集的牛奶樣品檢測(cè)限可達(dá)5cfu/mL。

七、免疫磁珠—量子點(diǎn)技術(shù)

白冰等[16]將生物素化兔抗金葡菌多抗偶聯(lián)于鏈親和素磁珠制備免疫磁性微粒，用其富集金黃色葡萄球菌，再利用量子點(diǎn)熒光標(biāo)記和微型光纖光譜儀進(jìn)行菌體檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)金葡菌最佳富集條件為捕獲時(shí)間45min，磁分離1.5min，PBS濃度10mmol/L，可以捕獲103cfu/mL濃度的菌液。整個(gè)檢測(cè)可以在2h內(nèi)完成，并且具有較高的特異性。

李倩倩等[17]建立了一種免疫磁珠和量子點(diǎn)相結(jié)合檢測(cè)金葡菌、志賀菌和沙門(mén)菌的方法。先用包被有三種目標(biāo)菌多抗的免疫微球富集目標(biāo)菌，再加入用多色CdSe量子點(diǎn)交聯(lián)的抗金葡菌、抗志賀菌和沙門(mén)菌多抗反應(yīng)，通過(guò)熒光顯微成像法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，可在2h內(nèi)對(duì)同一反應(yīng)體系中的3中目標(biāo)菌進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)樣品中目標(biāo)菌的檢測(cè)表明檢測(cè)靈敏度可達(dá)103cfu/mL，表明該方法是一種能夠快速、特異靈敏地檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。

八、結(jié)論

金黃色葡萄球菌引起的感染和食物中毒是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，基于細(xì)菌培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法雖然是目前通用的檢測(cè)方法，但是需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，不能進(jìn)行快速和微量檢測(cè)，不利于盡早診斷和治療。而隨著相關(guān)生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，基于分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及生物傳感器等快速且高靈敏度檢測(cè)方法，將是今后開(kāi)展病原菌檢測(cè)的發(fā)展方向。

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