李寶悅 卜祥點 陳文軒 馬 娜 張目涵 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，是以腸道黏膜免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子聚集為特征的非特異性腸道炎癥性疾病，其病因與腸黏膜上皮屏障損傷、腸道微生態(tài)紊亂、遺傳易感性、宿主自身免疫等因素密切相關(guān)。微RNAs(miRNAs)是一組由基因組編碼的長度約22個核苷酸殘基的高度保守的短鏈非編碼RNA，可與目標(biāo)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)在多種自身免疫病和腫瘤的發(fā)病中起重要作用。隨著對miRNAs了解的增加，認(rèn)為miRNAs可調(diào)節(jié)IBD患者的促炎細(xì)胞因子表達(dá)和免疫細(xì)胞功能，影響腸黏膜屏障完整性，改變腸道共生菌群組成和毒力，并將為IBD的診斷和治療帶來新思路和方法。本文就miRNAs與腸道促炎細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞和腸黏膜屏障功能，以及miRNAs在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用作一綜述。

一、MiRNAs與促炎細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞

1. MiRNAs與Th1/Th17細(xì)胞：初始T細(xì)胞可分化為Th1和Th17細(xì)胞，這兩種細(xì)胞的發(fā)育和效應(yīng)過程可由STAT和NF-κB激活[1-2]。TNF-α可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞中miRNAs表達(dá)，進(jìn)一步激活STAT和NF-κB，影響Th1/Th17細(xì)胞分化。He等[3]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可上調(diào)CD4+T細(xì)胞中miR-301a表達(dá)，后者通過靶向抑制Smad核內(nèi)相關(guān)蛋白1(SNIP1)上調(diào)NF-κB通路活性，促進(jìn)IBD患者外周血CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化并上調(diào)IL-17A、TNF-α、RORC表達(dá)。Mycko等[4]對自身免疫性脫髓鞘病的研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a通過激活I(lǐng)L-6介導(dǎo)的STAT3途徑促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，這一作用與STAT通路激活抑制蛋白(PIAS)的下調(diào)有關(guān)。此外，IL-6、IL-23、IL-12和TNF-α可明顯抑制IBD患者外周血CD4+T細(xì)胞中miR-219a-5p表達(dá)，miR-219a-5p的降低通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ETV5使STAT3和STAT4磷酸化，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Th1/Th17細(xì)胞并產(chǎn)生IFN-γ、IL-17A、IL-21和TNF-α等促炎細(xì)胞因子[5]。由此可見，miRNAs在CD4+T細(xì)胞分化和促炎細(xì)胞因子表達(dá)中發(fā)揮了中間調(diào)節(jié)的作用。

2. MiRNAs與Th2細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞：Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13，IL-13可加速纖維化、損傷腸上皮細(xì)胞并破壞黏膜屏障功能，與UC發(fā)生密切相關(guān)[1]。MiRNAs可影響Th2細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌從而在哮喘的發(fā)生中起重要作用，但對UC患者的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。在過敏原誘導(dǎo)的氣管過敏性炎癥模型中，miR-155參與了CD4+T細(xì)胞活化、Th2細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌，并介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥組織聚集[6-7]。MiR-221-3p在小鼠哮喘模型中可靶向抑制CXC趨化因子配體17(CXCL17)，通過p38MAPK通路使IL-13介導(dǎo)的CCL24和CCL26表達(dá)增加，加重氣管炎癥和嗜酸性粒細(xì)胞聚集[8]。Liang等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p可抑制氣管上皮細(xì)胞中CCL26表達(dá)，對Th2細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥發(fā)揮保護(hù)作用。但miRNAs是否也參與了IBD患者Th2細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)和UC患者炎性組織中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤仍需更多實驗證實。

3. MiRNAs與Treg細(xì)胞：Treg細(xì)胞表達(dá)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3并分泌TGF-β和IL-10，發(fā)揮免疫抑制作用。其中自然Treg細(xì)胞(nTreg細(xì)胞)和誘導(dǎo)Treg細(xì)胞(iTreg細(xì)胞)與IBD的關(guān)系最為密切[1]。胸腺發(fā)育時期Dicer酶缺失導(dǎo)致的miRNAs成熟障礙會引起nTreg細(xì)胞發(fā)育和遷移障礙，影響Foxp3表達(dá)，并損傷Treg細(xì)胞的免疫抑制功能和IL-10、IL-35的分泌，誘發(fā)自身免疫病[10]。Lu等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-155缺失小鼠nTreg和iTreg細(xì)胞數(shù)量和比例均減少，且miR-155可通過抑制細(xì)胞因子信號抑制因子1(SOCS1)促進(jìn)IL-2信號通路激活和STAT5磷酸化，有利于Treg細(xì)胞發(fā)揮競爭優(yōu)勢并維護(hù)細(xì)胞增殖潛能和表型穩(wěn)定。而在小鼠結(jié)腸炎模型中，TNF-α介導(dǎo)的Treg細(xì)胞免疫抑制功能的破壞與miR-106a高表達(dá)有關(guān)，后者通過結(jié)合NF-κB啟動子抑制IL-10釋放的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]?？傊?，miRNAs可通過影響Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)參與IBD的發(fā)病。

4. MiRNAs與抗原呈遞細(xì)胞(APC)：腸黏膜固有層樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞是IBD患者炎癥組織中最為關(guān)鍵的APC，可分泌IL-1、IL-6、IL-12家族和TNF-α等促炎細(xì)胞因子[13]。Asadirad等[14]使用外泌體傳遞miR-155并與DC進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示miR-155可促進(jìn)未成熟DC樹突形成和胞質(zhì)空泡化并升高CD40、CD83、CD86表達(dá)，誘導(dǎo)效果類似于脂多糖(LPS)。且miR-155還可促進(jìn)DC分泌IL-12p70和促進(jìn)T細(xì)胞增殖。在IBD患者腸道炎癥組織中，miR-10a可靶向抑制單核細(xì)胞源性樹突細(xì)胞(MODC)中IL-12/IL-23p40表達(dá)并抑制DC活化，阻礙CD4+T細(xì)胞分化[15]。

巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活(M1)巨噬細(xì)胞和替代激活(M2)巨噬細(xì)胞，其極化過程需STAT家族、NF-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)等轉(zhuǎn)錄因子參與[16]。Xu等[17]發(fā)現(xiàn)Akt1缺失小鼠的巨噬細(xì)胞通過miR-155/SOCS1軸使NF-κB的活化作用增強，從而促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，增加IL-6、TNF-α和活性氮中間體的分泌，在金黃色葡萄球菌的感染中表現(xiàn)出更明顯的急性炎癥反應(yīng)和更強的殺菌作用。Zhang等[18]對小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，miR-155缺失可抑制M1巨噬細(xì)胞極化，同時通過提高STAT6磷酸化水平促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。尼古丁可通過作用于α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)miR-124，后者通過靶向STAT3減少IL-6的分泌，發(fā)揮炎癥抑制作用[19]。

5. MiRNAs與中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞：IBD活動期可見中性粒細(xì)胞浸潤和數(shù)量增加，在疾病緩解期減少。MiR-129-2-3p作用于靶基因Casp6和Ccr2，影響中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡過程，其高表達(dá)可促進(jìn)2型糖尿病小鼠的皮膚傷口愈合[20]。MiR-223下調(diào)IL-6從而間接抑制p47phox，故miR-223缺失小鼠更易發(fā)生酒精介導(dǎo)的肝臟中性粒細(xì)胞浸潤和活性氧的產(chǎn)生[21]。Hsa-miR-4780和hsa-miR-3938通過調(diào)控N2型腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞，參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。但miRNAs對中性粒細(xì)胞功能的調(diào)控與IBD活動期的關(guān)系仍需行更多的實驗證實。此外，miR-155參與了腸系膜淋巴結(jié)的生發(fā)中心B細(xì)胞激活和抗體分泌過程，使小鼠血清抗-dsDNA IgM、IgG、IgA和抗Ro60/SSA IgG、抗-La/SSB IgG顯著升高，這可能介導(dǎo)了多種自身免疫病的發(fā)生[23]。

二、MiRNAs與腸黏膜屏障

腸黏膜屏障阻止了食物和腸道微生物與固有層免疫細(xì)胞接觸引發(fā)的自身免疫反應(yīng)，并為抗菌分子高濃度富集提供環(huán)境，參與上皮細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。雖然腸上皮屏障損傷與IBD發(fā)病的因果關(guān)系目前尚未明確，但有報道顯示CD患者一級親屬的腸黏膜上皮對大分子的通透性升高，且這種通透性改變可出現(xiàn)在CD發(fā)病前[24]。MiRNAs參與調(diào)節(jié)腸上皮屏障通透性，在IBD發(fā)病中起有作用。

1. MiRNAs與腸黏膜細(xì)胞屏障：腸上皮細(xì)胞、細(xì)胞間連接等共同構(gòu)成腸黏膜細(xì)胞屏障。細(xì)胞間連接主要包括緊密連接和黏附連接等。MiRNAs在腸黏膜上皮細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞分化、損傷修復(fù)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用。MiR-200b可增加細(xì)胞周期S期并減少G1期，增加cyclin D1蛋白表達(dá)，改變細(xì)胞周期，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。此外，miR-200b還可通過靶向抑制ZEB1和SMAD2表達(dá)促進(jìn)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)并抑制波形蛋白(vimentin)表達(dá)，阻礙上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[25]。尼古丁介導(dǎo)的miR-124上調(diào)可加速IL-6誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞增殖和遷移，并減少IL-8和TNF-α的釋放[19,26]。Tian等[27]發(fā)現(xiàn)miR-31缺失小鼠在DSS誘導(dǎo)過程中表現(xiàn)出結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖減少且細(xì)胞凋亡增加。Dalmasso等[28]發(fā)現(xiàn)Caco2-BBE細(xì)胞和HT29-Cl.19A細(xì)胞不同分化時期的miRNAs表達(dá)譜不同，以miR-99b、miR125a-5p、anti-miR-1269轉(zhuǎn)染Caco2-BBE細(xì)胞后，細(xì)胞生長速率和跨上皮電阻明顯降低，并表現(xiàn)出HT29-Cl.19A細(xì)胞的表型，提示miRNAs參與人腸上皮細(xì)胞分化。

MiRNAs對細(xì)胞間連接蛋白也具有調(diào)節(jié)作用。Nakata等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p可與其靶點PTEN、PDCD4結(jié)合，分別通過PI3K/Akt、JNK/AP-1通路，增加AFR4表達(dá)，抑制腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接組成蛋白claudin-4和occludin表達(dá)。MiR-15a可在TNF-α的誘導(dǎo)下抑制細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)，從而降低ZO-1蛋白和E-cadherin表達(dá)，破壞緊密連接和黏附連接[30]。

2. MiRNAs與腸黏膜分泌屏障：分泌屏障是位于腸上皮細(xì)胞管腔側(cè)的厚黏液層，相當(dāng)于腸黏膜的化學(xué)和免疫屏障，其主要由黏蛋白、免疫球蛋白(sIgA、IgG、IgM等)、抗菌肽、凝集素、腸三葉肽(ITF/TFF3)等組成[31]。在miR-146a缺失小鼠的小腸細(xì)胞中，C型凝集素抗菌肽Reg3家族和MUC3、MUC4基因表達(dá)明顯升高，且腸道集合淋巴結(jié)(Peyer’s Patch)中濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh細(xì)胞)和生發(fā)中心B細(xì)胞數(shù)量明顯增加，兩者相互作用的增強可促進(jìn)生發(fā)中心B細(xì)胞分泌IgA，這一系列變化提示低濃度miR-146a有助于維持腸黏膜屏障的完整性[32]。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠Treg細(xì)胞中，miR-155通過抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)，減少濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tfr細(xì)胞)的產(chǎn)生，Tfr細(xì)胞快速下降可導(dǎo)致小鼠腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)的生發(fā)中心B細(xì)胞大量增多并產(chǎn)生多種免疫球蛋白，可能與IBD、其他自身免疫病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[23]。此外，Guo等[33]發(fā)現(xiàn)miR-7-5p可通過抑制PI3K/Akt信號通路使TFF3表達(dá)減少，抑制腸上皮黏膜細(xì)胞增殖和損傷組織修復(fù)。有研究[34]發(fā)現(xiàn)抑制miR-7可升高TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中的TFF3表達(dá)，對IBD起有保護(hù)作用。因此，miRNAs的穩(wěn)定表達(dá)有助于維持腸黏膜分泌屏障功能。

3. MiRNAs與腸黏膜生物屏障：腸道微生態(tài)紊亂、菌群豐度下降、細(xì)菌毒力改變等因素可破壞腸黏膜生物屏障，誘導(dǎo)IBD的發(fā)病。隨著近年對細(xì)胞外miRNAs研究的增加，糞便miRNAs被認(rèn)為參與IBD患者腸道菌群變化的調(diào)節(jié)，并與IBD病情活動度和疾病預(yù)后評估密切相關(guān)。

糞便miRNAs主要由腸黏上皮細(xì)胞分泌，可通過胞外囊泡(EV)形式(如微囊泡、外泌體等)和非EV形式釋放[35]，腸道微生物可通過miRNAs調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)[36]，反之，miRNAs可主動并有選擇性地進(jìn)入腸道細(xì)菌，影響細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄和增殖[35]。Ji等[37]的研究表明miR-1226、miR-515-5p可抑制大腸埃希菌(E.coli)和具核酸桿菌(Fn)增殖，并促進(jìn)腸道分節(jié)絲狀菌(SFB)的生長。而miR-148-3p、miR-27-3p表達(dá)與IBD患者腸道變形菌(Proteobacteria)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)數(shù)量升高密切相關(guān)[38]。MiR-21缺失小鼠腸道菌群中擬桿菌門(Bacteroidetes)減少，厚壁菌門(Firmicutes)、保護(hù)性梭狀芽孢桿菌目(Clostridia)豐度升高，這種腸道菌群變化可在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中發(fā)揮保護(hù)作用[39]。而布拉酵母菌可降低結(jié)腸炎小鼠腸道高表達(dá)的miR-155和miR-223，這一改變可使結(jié)腸炎小鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門比例恢復(fù)至健康小鼠水平[40]。綜上所述，IBD患者糞便miRNAs表達(dá)異?？赏ㄟ^影響腸道微生物組成調(diào)節(jié)IBD發(fā)病的機(jī)制。

三、MiRNAs與IBD診治新思路

1. MiRNAs與IBD的診斷：相比于傳統(tǒng)的C反應(yīng)蛋白(CRP)和內(nèi)鏡檢查，miRNAs檢驗結(jié)果具有較高的特異性和敏感性，且用于臨床檢驗更方便、經(jīng)濟(jì)，在IBD患者的診斷尤其是對于活動期患者病情嚴(yán)重程度評估中發(fā)揮重要的生物學(xué)標(biāo)志物潛能。Chen等[41]的研究結(jié)果顯示，外周血miR-146b-5p在UC和CD中分別升高2.72倍和2.87倍，而在腸結(jié)核和其他非IBD腸病(如缺血性腸炎、感染性腸炎、藥物性腸炎等)中無明顯升高。糞便miR-1246明顯升高或可為IBD合并艱難梭菌感染(CDI)的診斷提供可靠證據(jù)[42]。

2. MiRNAs與IBD的治療：在IBD治療方面，miRNAs的模擬物和反義抑制物可糾正內(nèi)源性miRNAs失調(diào)，已在動物實驗中取得了不錯的效果[43]。給予TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠反義miR-301a處理后，小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度、組織病理評分等改善程度優(yōu)于對照組，且結(jié)腸組織CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤減少[3]。但某些miRNAs靶點較多、作用機(jī)制復(fù)雜且效應(yīng)廣泛，針對于miRNAs的IBD治療是否能解決不良反應(yīng)和安全性的問題仍值得進(jìn)一步研究。

四、結(jié)語

綜上所述，miRNAs可通過與促炎細(xì)胞因子相互影響，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化和分泌功能，還可影響腸黏膜屏障功能，并參與調(diào)節(jié)腸道共生菌群的構(gòu)成和毒力。此外，部分miRNAs在IBD患者體內(nèi)的表達(dá)具有較高的特異性和敏感性，可作為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，并有望在IBD的治療中提供新的方法。