12類68種獸藥殘留同步檢測(cè)方法的建立

鹿翠珍 王建娜 溫春曉 王立國(guó) 西迎/正大集團(tuán)（秦皇島正大有限公司）066200

錯(cuò)綜復(fù)雜的全球食品供應(yīng)鏈既豐富了中國(guó)消費(fèi)者的餐桌文化，也為食品安全的保障工作帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。如今，食品安全不再是傳統(tǒng)的單個(gè)國(guó)家、企業(yè)或者行業(yè)組織就能解決的問題，而是需要全食品產(chǎn)業(yè)鏈乃至更廣泛的社會(huì)力量的通力合作與共同治理。隨著畜牧業(yè)規(guī)?；?、商業(yè)化的發(fā)展，獸藥及飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛運(yùn)用及食品數(shù)量和品種的急劇增多，獸藥管控項(xiàng)目增加，限量加嚴(yán)，檢測(cè)面臨著人員、設(shè)備和空間的投入，越來(lái)越高昂的檢測(cè)費(fèi)逐漸成為企業(yè)監(jiān)管瓶頸，因此急需要高效的精確的檢測(cè)技術(shù)做保障。我們的科研方法就是本著這樣的服務(wù)理念，采用獸殘同步檢測(cè)法，實(shí)現(xiàn)多種獸藥殘留快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料

標(biāo)準(zhǔn)品：（純度96%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為德國(guó)Dr公司生產(chǎn)）、金剛烷胺D15（內(nèi)標(biāo)）、氘帶磺胺甲惡唑內(nèi)標(biāo)、氘帶諾氟沙星內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)羅紅霉素：(純度99%，德國(guó))、甲醇（高效液相色譜級(jí)Dikma）、甲酸（高效液相色譜級(jí)Kermel）、乙腈（高效液相色譜級(jí)）、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、實(shí)驗(yàn)用水（超純水）、檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸，用水溶解，定容至1000mL。磷酸氫二鈉溶液：0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000mL。Mellvaine緩沖液：將1000mL 0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=4.0±0.05。Na2EDTA-Mellvaine緩沖液: 0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mL Mellvaine緩沖液，使其溶解、搖勻。甲醇水溶液（5%）：稱量25mL甲醇與475mL水混合。定溶液：475mL水與25MmL乙腈與1.5mL甲酸混合。Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60mg，美國(guó)Waters公司，使用前依次用5mL 甲醇，10mL 水活）。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至適宜濃度。

混合內(nèi)標(biāo)工作液：使用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至適宜濃度。

1.2 儀器

API4500串聯(lián)質(zhì)譜儀、高速冷凍離心機(jī)、渦旋混合器、超聲波、氮吹儀 精密分析天平（感量0.00001g）；天平（感量0.01g）、振蕩器、絞肉機(jī)、空氣真空泵、尼龍微孔過濾膜：∮ 0.22μm、酸度計(jì)。

1.3 分析步驟

1.3.1 試樣的提取和凈化 準(zhǔn)確稱取2.00g(精確至0.01g)試樣至 50mL 離心管中，加入20mL 0.1mol/L Na2EDTAMellvaine緩沖液溶液，振蕩15min，8000r/min，離心10min。移取上清液于上述已活化的HLB固相萃取柱中，控制流速為1mL/min，先用5mL水淋洗、再用3mL 5% 甲醇溶液淋洗，流干后真空泵抽干，然后用5mL 甲醇分兩次洗脫。洗脫液在60℃水浴中氮?dú)獯抵两?，?.0mL定溶液，渦旋30s溶解，用0.2μm濾膜過濾后供液相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.2 混合基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的制備 稱取5個(gè)陰性2.00g（精確至0.01g）試樣至 50mL離心管中，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及混合內(nèi)標(biāo)工作液，按照1.3.1步驟進(jìn)行同步提取和凈化。

1.4 色譜條件

色譜柱：Kinete?2.6μm 50×3.0mm。流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）、乙腈（B）具體見表1。流速：400ul/min。

表1 流動(dòng)相比例

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI源）、輔助加熱器溫度：500℃、正離子方式掃描/負(fù)離子掃描、檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：5.5kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

肉類樣品的主要成分是水(高達(dá)70%)、蛋白質(zhì)(15%～25%)、脂肪(5%～25%)和磷脂(1%～3%)。蛋白含量高，選用沉淀蛋白效果佳的物質(zhì)作為提取劑，本研究分別用乙腈、三氯乙酸、乙酸鉛、Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在提取過程中，Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液凈化處理效果最佳，試驗(yàn)過程中用0.1mol/L Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液變性形成沉淀，通過離心后除去。

2.2 提取方式的選擇

分別采用渦旋、超聲波提取、均質(zhì)提取和振蕩4種提取方式。結(jié)果表明，振蕩提取效果最好，而且回收率比較穩(wěn)定，因此本方法采用振蕩的提取方式。

2.3 凈化方法

動(dòng)物源性食品中基質(zhì)復(fù)雜，凈化樣品，降低雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響十分重要。凈化過程我們選用獸殘常用前處理柱MCX小柱、HLB小柱、C18。MCX小柱68項(xiàng)滿足回收率要求項(xiàng)目有48項(xiàng)，成功率為70.6%，其中四環(huán)素族和大抗球蟲類 無(wú)法保留，不采??；C18小柱68項(xiàng)滿足回收率要求項(xiàng)目有45項(xiàng)，成功率為66.2%，其中磺胺類、喹諾酮類及酰胺醇類無(wú)法保留，不采?。籋LB小柱68項(xiàng)全部滿足回收率要求，因此本方法采用HLB凈化柱。

2.4 流動(dòng)相梯度選擇

本試驗(yàn)包括正離子和負(fù)離子，流動(dòng)相的pH值影響正負(fù)離子的離子化，采用0.005%甲酸-乙腈水溶液，0.01%甲酸-乙腈水溶液，0.1%甲酸-乙腈水溶液，0.2%甲酸-乙腈水溶液，0.5%甲酸-乙腈水溶液 逐個(gè)梯度摸索流動(dòng)相條件，結(jié)果表明，0.1%甲酸-乙腈流動(dòng)相體系在一定梯度下可以很好地將68種獸殘分離開來(lái)，其靈敏度和分辨率都滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

在應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定復(fù)雜樣品時(shí)，基質(zhì)對(duì)于藥物的響應(yīng)有很大不同，對(duì)不同的藥物具有增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，從而影響定量的準(zhǔn)確性。本方法為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，日常定量用標(biāo)準(zhǔn)曲線采用5點(diǎn)及以上陰性樣本添加方式。

2.6 方法的檢出限、回收率、重復(fù)性及線性范圍

以陰性雞肉為代表，按照上述處理方法對(duì)樣品中68種獸藥進(jìn)行10、20、50μg/kg等3個(gè)濃度水平的添加回收試驗(yàn)，其平均回收率在82.2%～102.6% 之間，RSD在2.9%～20.9%之間。本試驗(yàn)采用在空白組織中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)特征離子色譜峰的3倍信噪比（S/N）計(jì)算最低檢出限，結(jié)果見表2。

表2

項(xiàng)目 母離子子離子 掃描模式線性范圍相關(guān)系數(shù)最低檢測(cè)限ppb替米考星 869.5 174.0 + 0.5-100 0.998 1 869.5 132.4 +吉他霉素 772.0 109.0 + 0.5-100 0.995 1 772.0 173.7 +泰樂菌素 916.6 174.0 + 0.5-100 0.998 1 916.6 145.4 +克林霉素 425.3 125.8 + 0.5-100 0.998 1 425.3 377.2 +土霉素 461.0 425.9 + 5-100 0.999 10 461.0 443.1 +四環(huán)素 445.1 410.0 + 5-100 0.996 10 445.1 154.0 +金霉素 479.1 444.0 + 5-100 0.997 10 479.1 462.3 +強(qiáng)力霉素 445.1 428.1 + 5-100 0.996 10 445.1 410.1 +克球酚 192.1 101.0 + 5-100 0.998 10 192.1 87.2 +卡巴氧 263.2 230.9 + 0.5-100 0.997 1 263.2 90.1 +喹乙醇 264.3 143.1 + 0.5-100 0.998 1 264.3 212.1 +阿奇霉素 749.6 591.7 + 0.5-100 0.998 1 749.6 157.9 +甲硝唑 172.1 127.9 + 0.5-100 0.998 1 172.1 82.1 +羥基甲硝唑 188.1 126.0 + 0.5-100 0.998 1 188.1 123.0 +二甲硝唑 141.9 96.1 + 0.5-100 0.996 1 141.9 81.1 +羥甲基甲硝唑158.1 140.1 + 0.5-100 0.999 1 158.1 112.2 +阿莫西林 366.0 114.2 + 5-100 0.996 10 366.0 208.3 +氨芐西林 350.0 160.2 + 5-100 0.996 10 350.0 191.9 +泰妙菌素 494.1 192.1 + 0.5-100 0.997 1 494.1 119.0 +金剛乙胺 180.2 163.1 + 0.5-100 0.997 1 180.2 121.2 +氯霉素 320.9 152.0 - 0.1-100 0.995 0.1 320.9 257.0 -地塞米松 436.9 361.3 - 0.5-100 0.999 1 436.9 307.4 -甲砜霉素 354.1 184.9 - 0.5-100 0.997 1 354.1 289.8 -氟苯尼考 356.1 335.7 - 0.5-100 0.996 1 356.1 185.2 -磺胺甲噻二唑271.0 156.0 + 5-100 0.996 10 271.0 108.0 +磺胺 唑 268.0 156.0 + 0.5-100 0.997 10 268.0 113.0 +

項(xiàng)目 母離子子離子 掃描模式線性范圍相關(guān)系數(shù)最低檢測(cè)限ppb磺胺醋酰 215.0 156.0 + 5-100 0.997 10 215.0 108.1 +苯甲酰磺胺 277.0 156.0 + 5-100 0.996 10 277.0 108.0 +磺胺苯吡唑 315.0 156.0 + 5-100 0.997 10 315.0 160.0 +磺胺鄰二甲氧嘧啶311.0 156.0 + 5-100 0.998 10 311.0 108.0 +磺胺異 唑 268.1 156.0 + 5-100 0.999 10 268.1 113.0 +甲氧芐啶 291.1 230.1 + 5-100 0.996 10 291.1 261.0 +泰萬(wàn)菌素 1042.6109.0 + 0.5-100 0.997 1 1042.6814.5 +氟苯尼考胺 248.0 230.0 + 0.5-100 0.997 1 248.0 130.0 +螺旋霉素 843.3 174.2 + 0.5-100 0.999 1 843.3 142.2 +磺胺氯吡嗪 285.2 156.2 + 5-100 0.997 10 285.2 108.3 +喹乙醇代謝物189.2 145.1 + 0.5-100 0.998 1 189.2 143.1 +苯硫胍 447.1 383.0 + 5-100 0.996 10 447.1 415.0 +芬苯噠唑 300.0 267.9 + 5-100 0.995 10 300.0 158.7 +氨丙啉 243.0 150.0 + 5-100 0.997 10 243.0 94.0 +阿苯達(dá)唑 266.0 233.9 + 5-100 0.998 10 266.0 190.9 +奧芬達(dá)唑 316.0 158.9 + 5-100 0.995 10 316.0 190.9 +阿維拉菌素 249.0 190.3 - 5-100 0.999 10 249.0 205.0 -

3 結(jié)論

本方法建立了動(dòng)物源性食品中68種藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，回收率和檢測(cè)限GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F的規(guī)定，，適合動(dòng)物源性食品中12類68種藥物殘留的日常分析。