雞細(xì)菌性病原多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

余春林 楊禮 陳家磊 胡陳明 彭涵 邱莫寒 虎彪 楊朝武

1.四川省畜牧科學(xué)研究院動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 610066

2.四川大恒家禽育種有限公司 610066

3.四川省正鑫農(nóng)業(yè)科技有限公司 610400

雞沙門氏菌、大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌是危害雞群健康的常見細(xì)菌性病原，在我國各個(gè)代次雞群中普遍存在，嚴(yán)重危害產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。多重PCR法已廣泛用于病原菌的同時(shí)檢測和鑒定，具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)性和簡便性。

林下養(yǎng)殖是充分利用林地資源，兼顧生態(tài)與經(jīng)濟(jì)效益的生產(chǎn)方式，在動物福利、生產(chǎn)性能、蛋肉風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值、植被保護(hù)等方面具有一定的優(yōu)勢。放牧及植物、土壤的攝取使雞更頻繁地暴露于環(huán)境污染物和病原體中，因此具有更高的食品安全和疾病感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。本研究建立了一種能快速檢測禽沙門氏菌、大腸桿菌和多殺氏巴氏桿菌的多重PCR方法，并應(yīng)用于林下養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌性病原感染情況調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集 采用五點(diǎn)法采集無污染荒坡0-5cm土層5-10g，研磨過篩、高溫滅菌后，-80℃保存?zhèn)溆谩ＥR床樣本采用同樣的方法采集，不經(jīng)滅菌直接保存。

1.2 菌株 標(biāo)準(zhǔn)品沙門氏菌CVCC504、腸出血性大腸桿菌CVCC245、A型巴氏桿菌、腸毒性大腸桿菌CVCC196、鴨疫里默氏菌均為動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank中登錄的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌（rfb E基因）和A型多殺巴氏桿菌序列設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 引物信息

1.4 細(xì)菌DNA提取 將3種標(biāo)準(zhǔn)品菌液等量混合，分為兩份，其中一份經(jīng)72℃水浴15min制成死菌懸液。參考何偉等[4]研究，將3種標(biāo)準(zhǔn)品菌液、活菌懸液和死菌懸液分別按105cfu/g加入5份滅菌土壤中混勻。采用土壤DNA分離試劑盒提取DNA，經(jīng)質(zhì)量濃度測定后稀釋至50ng/ml。鴨疫里默氏菌和腸毒性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取細(xì)菌DNA。

1.5 PCR擴(kuò)增 單重PCR采用25ul反應(yīng)體系，包括DNA模板1ul，上下游引物各1uL，2×PCRmix 18ul，ddH2O 4uL。采用50ul體系對多重PCR的引物濃度、退火溫度、反應(yīng)程序等進(jìn)行優(yōu)化。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.6 方法驗(yàn)證 以1.4中提取的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌和A型巴氏桿菌DNA混合液為模板，同時(shí)以鴨疫里默氏菌DNA、腸毒性大腸桿菌CVCC196 DNA、ddH2O為模板，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行特異性檢測檢測，并重復(fù)3次以檢測結(jié)果的可靠性。靈敏度檢測包括10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等5個(gè)梯度。以活菌懸液和死菌懸液DNA為模板進(jìn)行死菌和活菌鑒別。

1.7 多重PCR對臨床樣品的檢測 樣本來源于38個(gè)放養(yǎng)場，樣本采集方法見1.1.1，并通過問詢記錄各場存欄品種、日齡、消毒方法等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌DNA提取 經(jīng)檢測OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間，可以用于后續(xù)PCR檢測。

2.2 PCR方法的建立 3種標(biāo)準(zhǔn)品分別與土壤混合后提取的DNA，經(jīng)單重PCR擴(kuò)增，均能得到288bp、495bp和1044bp的特異性條帶。經(jīng)優(yōu)化，多重PCR反應(yīng)采用50ul反應(yīng)體系，包括：DNA模板2ul，10umol/L上下游引物各2uL，2×PCRmix 36ul。最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；加入引物P1，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5個(gè)循環(huán)；加入引物P2，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5個(gè)循環(huán)；加入引物P3，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2.3 方法驗(yàn)證 特異性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅活菌懸液能出現(xiàn)288bp、495bp和1044bp條帶，其他工作液不能擴(kuò)增出特異性條帶；3次重復(fù)結(jié)果一致。DNA測序結(jié)果與Gen Bank中序列完全一致。說明該方法能特異性檢測出沙門氏菌、A型巴氏桿菌和腸出血性大腸桿菌，能區(qū)分樣品中的死菌與活菌。靈敏度分析顯示5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液均能檢出特異性條帶。

2.4 對臨床樣品的檢測 基于上述建立的方法，對采集的38份土壤樣本的細(xì)菌性病原感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示所有樣本均未檢出A型巴氏桿菌；腸毒性大腸桿菌和沙門氏菌陽性率分別為68.42%和89.47%；混合感染率為36.84%。不同品種、不同日齡雞群均有檢測到不同細(xì)菌性病原感染。

3 討論

多重PCR是針對待測病原設(shè)計(jì)特異性引物，在同一體系內(nèi)反應(yīng)并同時(shí)檢測出多種病原，能極大減少試劑、人工、時(shí)間成本，在疾病的及時(shí)確診方面具有優(yōu)勢。本研究中擴(kuò)增特異性分析顯示該方法能有效擴(kuò)增出沙門氏菌、A型巴氏桿菌和腸出血性大腸桿菌，而作為對照的鴨疫里默氏菌、腸毒性大腸桿菌不能檢出；試驗(yàn)中設(shè)置的5個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液均能檢出特異性條帶，具有較高的靈敏性，能滿足臨床檢測的需要；死菌懸液不能檢出特異性條帶，能有效區(qū)分土壤樣本中的活菌和死菌；3次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一致性為100%，具有較好的重復(fù)性。

雞沙門氏菌、大腸桿菌是長期存在于雞群的腸道病原菌，多殺性巴氏桿菌主要引起呼吸道癥狀。放養(yǎng)雞生產(chǎn)水平低下，環(huán)境可控性差，疾病防控壓力巨大。據(jù)報(bào)道四川7個(gè)地區(qū)養(yǎng)雞場雞沙門氏菌感染的場陽性率達(dá)50%[5]。本研究中所有場樣本均檢出1-2種病原感染，其中沙門氏菌和大腸桿菌感染以及混感情況嚴(yán)重；所有樣本均未檢出多殺性巴氏桿菌，可能與其流行病學(xué)特征有關(guān)。不同品種、不同日齡雞群均存在感染，提示各放養(yǎng)場均存在不同程度的生物安全漏洞，應(yīng)從引種、飼養(yǎng)管理等多方面入手。