高菜硫代葡萄糖苷提取物對人結(jié)腸癌細胞HCT116的抑制作用

田 艷，鄧放明*，趙玲艷，廖 安，賴燈妮，陳秋佳

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）（glucosinolate，GSL）及其降解產(chǎn)物是十字花科植物中的一類含硫次生代謝產(chǎn)物，不僅具有預(yù)防慢性疾?。òㄐ难芗膊?、糖尿病、肥胖癥等）、防癌抗癌、抗氧化等多種生物活性，還是十字花科蔬菜風(fēng)味和氣味形成的重要前體物質(zhì)，硫苷是目前國際上研究的熱門課題之一[1-3]。十字花科植物中硫苷類物質(zhì)的含量、種類及其生物活性隨種類品種、栽培技術(shù)、生長環(huán)境和加工處理不同有較大的變化。高菜（Brassica junceavar.integlifolia），又名紫脈大葉芥菜，屬于十字花科蕓苔屬植物，由葉用芥菜寬柄芥變種而來，其植株高約50 cm，葉柄寬厚，葉片寬大，葉脈紫紅色，耐寒、耐抽薹，產(chǎn)量高，商品性好，高菜性喜冷涼濕潤，適宜生長溫度為l5～20 ℃[4]。近年來，高菜是湖南和浙江等省廣泛種植的用于腌制菜加工的主要原料，發(fā)酵加工后其質(zhì)地脆嫩，味道鮮美，深受消費者的青睞[5-7]。但高菜中硫苷類物質(zhì)的含量和種類鮮有報道，Jo等[8]報道了高菜硫苷具有降血糖作用，Yoo等[9-10]報道了高菜硫苷的抗氧化和降血壓作用。十字花科植物硫苷的抗癌活性有較多研究[11-13]，主要活性成分是硫苷的分解產(chǎn)物，如異硫氰酸酯、腈、硫氰酸酯、乙硫腈和惡唑烷類等，尤其是黑介子苷以及其降解產(chǎn)物異硫氰酸烯丙酯、蘿卜硫素、吲哚-3-甲醇等的抗癌研究報道較多[14-16]，據(jù)報道吲哚-3-甲醇和蘿卜硫素能顯著抑制結(jié)腸癌細胞[17]，但鮮有關(guān)于高菜硫苷的抗癌功效的報道。

目前，結(jié)腸癌是人群中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人們的生命健康，研究新型天然抗結(jié)腸癌物質(zhì)越來越受到人們關(guān)注，人結(jié)腸癌細胞株HCT116是結(jié)腸癌體外實驗研究最常用的材料[18-19]。因此，本實驗采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)分析高菜硫苷提取物中主要硫苷類物質(zhì)，并通過人結(jié)腸癌細胞株HCT116體外實驗初步研究高菜硫苷提取物的抗結(jié)腸癌效果，以期為揭示高菜的保健功能和高菜硫苷提取物的開發(fā)利用提供一定實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高菜：湖南省華容縣芥菜基地。

弱陰離子交換樹脂 鄭州和成新材料科技有限公司；黑芥子硫苷酸酶 上海恒斐生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶 北京酷來搏科技有限公司；過氧化物酶北京亞米生物科技有限公司；乙腈、甲酸、無水乙醇（色譜純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；人結(jié)腸癌細胞HCT116、CCD-18Co正常人結(jié)腸組織細胞 美國標準培養(yǎng)物收藏中心；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國VWR公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Hyclone公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、青霉素（penicillin）、鏈霉素（streptomycin）（美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（分析純）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）；磷酸酶抑制劑I、磷酸酶抑制劑II、胰蛋白酶、反β-肌動蛋白抗體（anti-β-actin antibodies） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、異丙醇、乙醇、氯仿（分子生物學(xué)級） 美國Fisher BioReagents公司；核糖核酸酶抑制劑、高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（high-capacity cDNA reverse transcription kit）、Green master mix SYBR美國Applied Biosystems公司；TRIzol RNA提取劑、膜聯(lián)蛋白-V、碘化丙啶（propidium iodide，PI） 美國Invitrogen公司；引物 美國Integrated DNA Technologies公司；細胞周期蛋白B、D1、E（Cyclin B、D1、E）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）和裂解半胱氨酸蛋白酶（Cleaved caspase-3） 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200型紫外-可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；1290 HPLC串聯(lián)6530 Q-TOF/MS 美國Agilent公司；Alpha 1-2 LDplus冷凍干燥儀 德國Christ公司；Micro 5417R高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾公司；Elx800TM酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；FACSort流式細胞儀 美國BD Bioscience公司；Odyssey CLx紅外成像系統(tǒng) 美國Li-Cor Bioscence公司；Hei-VAP G3 560-01302-00旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫公司；1645050型電泳儀美國伯樂公司；CB系列CO2培養(yǎng)箱 德國賓得公司；DNA Engine 2 Opticon實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀美國MJ Research公司；TS100倒置顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

從田間采收新鮮高菜，清洗表面污泥，晾干，切碎混勻并進行真空冷凍干燥，高速中藥粉碎機粉碎，過60 目篩，裝袋密封，放于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總硫苷的提取和純化方法

參照文獻[20-22]方法并作適當修改。提取方法：稱取2.0 g干燥樣品置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液，70 ℃恒溫水浴提取30 min，冷卻靜置，4 000×g離心10 min收集上清液，沉淀物再用30 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液重復(fù)提取2 次，合并3 次上清液，合并后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，待純化。純化方法：采用柱層析法進行純化，填料使用酸性氧化鋁，先用100 mL蒸餾水進行洗脫以平衡柱體，采用濕法上樣，每次上樣量為5 mL，然后用500 mL硝酸鉀溶液（0.1 mol/L）以3 mL/min的速率進行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積，再冷凍干燥得到粉末樣品。

1.3.3 總硫苷含量的測定

總硫苷含量的測定根據(jù)SN/T 1868—2007《進出口油菜籽及其餅粕中硫苷總量的測定》[23]。

分別取0.1 g高菜凍干粉末和高菜硫苷提取物凍干粉末分別溶解于100 mL蒸餾水中，分別取5 mL溶液流經(jīng)已活化的DEAE Sephadex A-25離子交換柱，加入5 mL醋酸鈉溶液（0.02 mol/L）清洗柱子以去除未結(jié)合的物質(zhì)，然后向?qū)游鲋屑尤?.0 mL黑芥子硫苷酸酶溶液（50 mg/mL），37 ℃恒溫水浴加熱1 h后，用3 mL超純水分3 次洗脫層析柱，混合洗脫液于10.0 mL容量瓶中，加入2.0 mL苯酚-鎢酸溶液，加水定容。從中準確吸取1.0 mL置于試管中，加入3.0 mL葡萄糖顯色液，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，用紫外-可見分光光度計在505 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準品葡萄糖含量及其吸光度繪制標準曲線，定量分析高菜凍干粉末和高菜硫苷提取物粉末中總硫苷含量。

1.3.4 硫代葡萄糖苷鑒定的高效液相色譜-質(zhì)譜條件

參照文獻[24-26]并作適當調(diào)整。色譜條件：色譜柱Phenomenex C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈；梯度條件：0～20 min：1%～45% B；20～30 min：45%～90% B；檢測波長210 nm；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；負離子模式；噴霧器壓力：35 psig；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：3 500 V；錐孔電壓：1 000 V；掃描離子范圍：m/z100.00～1 200.00；二級裂解電壓15～50 eV。

1.3.5 MTT法測定人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞活性

人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞活化并傳代至穩(wěn)定，傳代后培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中（溫度37 ℃，相對濕度5%），24 h后再將細胞種板于96 孔板中（細胞種板濃度為1.25×104個/mL），培養(yǎng)24 h后棄去上清培養(yǎng)液。將1.3.2節(jié)中高菜硫苷提取物凍干粉末用DMSO溶解并配成溶液，再分別取3 μL DMSO樣品溶液分別加入到3 mL的培養(yǎng)液中，最終得到質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、300、400、500、600 μg/μL高菜硫苷提取物的培養(yǎng)液。用移液槍將以上不同質(zhì)量濃度的高菜硫苷提取物的培養(yǎng)液移入棄去上清培養(yǎng)液的96 孔板中（200 μL/孔），培養(yǎng)24、48、72 h后用MTT法測定高菜硫苷提取物對細胞增殖的抑制作用，棄去含不同濃度硫苷提取物的培養(yǎng)液，每孔板中加入MTT溶液（0.5 mg/mL）100 μL，培養(yǎng)2 h，輕輕倒掉MTT溶液，加入100 μL DMSO溶解96 孔板中的紫色甲瓚晶體，輕輕拍打孔板外側(cè)邊緣混勻晶體，用酶標儀于570 nm處測定吸光度，計算細胞抑制率。同時對CCD-18Co細胞同樣處理以驗證高菜硫苷提取物對細胞的毒性。

1.3.6 細胞周期分析

將人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞（細胞濃度為2×104個/mL）接種在6 孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，倒掉上清培養(yǎng)液，每孔終加入高菜硫苷提取物（濃度根據(jù)1.3.5節(jié)中細胞活性結(jié)果及半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值確定）0.5 mL/孔，培養(yǎng)48 h，然后用胰蛋白酶分離細胞，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.4）洗滌，70%乙醇固定，-20 ℃下將細胞在黑暗中重懸于含有核糖核酸酶（50 μg/mL）和碘化丙啶溶液（200 μg/mL）的PBS中，空白對照同樣處理，最后使用流式細胞儀分析細胞周期[27-28]。

1.3.7 細胞凋亡分析

細胞種板及提取物處理細胞同1.3.6節(jié)，將細胞用PBS（10 mmol/L，pH 7.4）（0.5 mL/孔）洗滌，0.25%胰蛋白酶（0.5 mL/孔）分離細胞，然后各孔中加入結(jié)合緩沖液（1 mmol/L）0.3 mL，在黑暗中將細胞用凋亡液（含膜聯(lián)蛋白-V溶液（1 mmol/L）、FITC溶液（1 mmol/L）、PI溶液（200 μg/mL），體積比1∶1∶2）進行染色，空白對照同樣處理，室溫下放置30 min后使用流式細胞儀分析細胞凋亡[29-30]。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）分析高菜硫苷提取物對人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞相關(guān)蛋白的影響

實驗步驟參照文獻[31]并作適當調(diào)整。將人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞種于25 cm培養(yǎng)皿中（細胞濃度3.5×104個/mL，12 mL），培養(yǎng)24 h后，傾倒上清培養(yǎng)液，每平皿加入高菜硫苷提取物（濃度根據(jù)1.3.6節(jié)和1.3.7節(jié)中細胞周期和凋亡結(jié)果確定，12 mL）培養(yǎng)48 h，利用裂解液（裂解緩沖液RIPA（2×）、蛋白酶抑制劑（100×）、磷酸酶抑制劑Ⅰ（100×）、磷酸酶抑制劑I（100×），體積比50∶1∶1∶1）提取細胞蛋白質(zhì)，并采用考馬斯亮藍法對其蛋白含量進行檢測，加入相對應(yīng)體積的5 倍蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min進行蛋白變性，存于-80 ℃冰箱備用。

配制質(zhì)量分數(shù)12%丙烯酰胺分離膠50 mL，每次取約6 mL注入灌膠模具，靜置30 min，制成分離膠；配制質(zhì)量分數(shù)5%丙烯酰胺濃縮膠50 mL，每次取約2 mL注入灌膠模具，靜置60 min，制成濃縮膠。分別將濃縮膠和分離膠玻璃板裝入電泳裝置，上樣（5 μL標準蛋白上樣于兩側(cè)）后進行電泳，100 V電泳15 min，當樣品即將從濃縮膠進入分離膠時，更改電壓為160 V，繼續(xù)電泳45 min，直至目標蛋白完全分離開為止。取出凝膠進行蛋白轉(zhuǎn)膜（100 V，1 h 45 min），封閉，孵育一抗、二抗，然后使用紅外成像儀進行成像檢測。

1.3.9 qPCR檢測mRNA水平

總RNA提取：將人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞接種于25 cm培養(yǎng)皿中（細胞濃度3×105個/mL，12 mL）培養(yǎng)24 h，傾倒上清培養(yǎng)液，每平皿加入高菜硫苷提取物（濃度根據(jù)1.3.6節(jié)和1.3.7節(jié)中細胞周期和凋亡結(jié)果確定，12 mL）培養(yǎng)48 h，傾倒上清培養(yǎng)液加入0.5 mL TRIzol試劑進行吹打，靜置培養(yǎng)5 min待細胞完全溶解，加入0.1 mL氯仿，搖勻，輕漩渦后靜置3 min，離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），吸取上清液并加入0.25 mL異丙醇，搖勻后靜置10 min，離心（12 000×g，4 ℃，10 min），棄上清液留沉淀，加入0.5 mL 75%乙醇，搖勻，離心（7 500×g，4 ℃，5 min），棄掉上清液，真空干燥5 min，加入30 μL不含RNA酶的純水中溶解RNA，280 nm波長處測定吸光度并計算RNA的濃度，分裝于-80 ℃冰箱中備用。

按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)液，合成cDNA反應(yīng)參數(shù)為：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。qPCR儀循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃ 120 s，95 ℃ 15 s，50 ℃ 120 s，60 ℃ 60 s，40 個循環(huán)。

具體引物系列如表1所示[32-36]，將GAPDH用作內(nèi)源性對照，并根據(jù)GAPDH含量對每個樣品進行標準化。使用2－ΔΔCt方法計算目標基因的mRNA表達水平的相對定量，每個樣品重復(fù)3 次獨立平行實驗。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件計算細胞的IC50，細胞流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6軟件進行分析，WB采用Image J軟件對目標蛋白條帶光密度進行定量。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析處理，計量數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，采用單因素方差分析比較組間差異顯著性，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高菜硫苷含量測定結(jié)果

采用紫外分光光度法對新鮮高菜和高菜硫苷提取物中總硫苷的含量進行了檢測，結(jié)果顯示，新鮮高菜中總硫苷含量為15.45 mg/g；70%乙醇提取，高菜總硫苷的得率為1.545%；高菜硫苷提取物中總硫苷質(zhì)量分數(shù)為73.7%。

2.2 高菜硫苷提取物中硫苷成分分析結(jié)果

通過HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)得到高菜硫苷提取物的總離子流圖，如圖1所示。根據(jù)文獻報道的硫苷物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，對分子質(zhì)量的誤差值小于10×10-6（m/z）的化合物進行二級質(zhì)譜分析，利用二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行硫苷物質(zhì)結(jié)構(gòu)的初步解析，于保留時間1.855 min的主要峰中發(fā)現(xiàn)主要成分2-丙烯基硫苷，于保留時間8.781 min的主要峰中發(fā)現(xiàn)主要成分4-甲基硫代丁基硫苷，于保留時間10.126 min的主要峰中發(fā)現(xiàn)主要成分4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷，3 種硫苷化合物如與標準品進一步比對便可確認。其他主峰因沒有找到對應(yīng)的硫苷物質(zhì)，需要通過其他方法進行結(jié)構(gòu)分析。

圖1 高菜硫苷提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia

2.2.1 2 -丙烯基硫苷結(jié)構(gòu)解析結(jié)果

在高菜硫苷提取物中（保留時間1.855 min）發(fā)現(xiàn)主要化合物的離子碎片m/z358.026 8，與化合物2-丙烯基硫苷分子質(zhì)量一致，其二級質(zhì)譜圖如圖2所示，該化合物中有特征離子m/z274.990 8、259.011 3、241.002 2、195.031 7、161.985 1、138.969 3、116.016 8，結(jié)構(gòu)解析如圖3所示，碎片離子m/z241.002 2、259.011 3、195.031 7、274.990 8推測為2-丙烯基硫苷的硫與相鄰碳原子發(fā)生斷裂后形成，碎片離子m/z161.985 1推測為2-丙烯基硫苷的碳硫鍵（S-C1’）斷裂從而失去硫代葡萄糖基團與相鄰的氫（H-2’）而形成，碎片離子m/z138.969 3推測為硫酸化的葡萄糖發(fā)生裂解反應(yīng)形成。因此初步推測該化合物為2-丙烯基硫苷，本實驗推測的結(jié)果與相關(guān)文獻[37-38]報道一致。

圖2 2-丙烯基硫苷二級質(zhì)譜圖Fig.2 Tandem mass spectrum of 2-propenyl glucosinolate

圖3 2-丙烯基硫苷結(jié)構(gòu)解析Fig.3 Structure analysis of 2-propenyl glucosinolate

2.2.2 4 -甲基硫代丁基硫苷結(jié)構(gòu)解析結(jié)果

在高菜硫苷提取物中（保留時間8.781 min）發(fā)現(xiàn)m/z422.057 9離子碎片，與化合物4-甲基硫代丁基硫苷分子質(zhì)量一致，其二級質(zhì)譜圖如圖4所示，該化合物出現(xiàn)特征離子m/z259.011 1、195.023 2、163.042 2、96.961 0，結(jié)構(gòu)解析如圖5所示，碎片離子m/z259.011 1、195.023 2推測為4-甲基硫代丁基硫苷的硫與相鄰碳原子發(fā)生斷裂后形成，因此初步推測該化合物為4-甲基硫代丁基硫苷，本實驗推測的結(jié)果與相關(guān)文獻[39-40]報道一致。

圖4 4-甲基硫代丁基硫苷二級質(zhì)譜圖Fig.4 Tandem mass spectrum of 4-methyl thiobutyl glucosinolate

圖5 4-甲基硫代丁基硫苷結(jié)構(gòu)解析Fig.5 Structure analysis of 4-methyl thiobutyl glucosinolate

2.2.3 4 -甲氧基-3-吲哚甲基硫苷結(jié)構(gòu)解析結(jié)果

在高菜硫苷提取物中（保留時間10.126 min）發(fā)現(xiàn)m/z477.055 7離子碎片，與化合物4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷分子質(zhì)量一致，其二級質(zhì)譜圖如圖6所示，該化合物中有特征離子m/z235.052 0、195.031 6、96.058 9，結(jié)構(gòu)解析如圖7所示，碎片離子m/z235.052 0、195.031 6推測為4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷的硫與相鄰碳原子發(fā)生斷裂后形成，因此初步推測該化合物為4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷，目前未發(fā)現(xiàn)有文獻報道4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷在芥菜中被檢測到。

圖6 4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷二級質(zhì)譜圖Fig.6 Tandem mass spectrum of 4-methoxy-3-indolemethyl glucosinolate

圖7 4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷結(jié)構(gòu)解析Fig.7 Structure analysis of 4-methoxy-3-indolemethyl glucosinolate

2.3 高菜硫苷提取物抑制HCT116細胞生長的效果

通過MTT結(jié)果分析，高菜硫苷提取物以劑量和時間依賴性方式顯著降低了HCT116細胞的存活率（P＜0.05），如圖8A、C、E所示，硫苷提取物作用HCT116細胞24、48 h和72 h后，其IC50分別為181.9、81.1、80.6 μg/μL。但相同劑量的硫苷提取物對CCD-18Co正常結(jié)腸細胞沒有產(chǎn)生任何毒性，如圖8B、D、F所示。結(jié)果表明高菜硫苷提取物對HCT116細胞顯示出特異性抗增殖作用。

圖8 高菜硫苷提取物對結(jié)腸癌細胞增殖的影響Fig.8 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on the proliferation of colon cancer cells

2.4 高菜硫苷提取物對HCT116細胞周期和細胞凋亡的影響

根據(jù)2.3節(jié)的實驗結(jié)果，硫苷提取物作用HCT116細胞24 h和48 h后，其IC50從181.9 μg/μL降低至81.1 μg/μL，變化顯著，但硫苷提取物作用細胞48～72 h，其IC50變化極小，因此后續(xù)細胞周期、細胞凋亡、WB和qPCR實驗中細胞培養(yǎng)時間均選擇48 h。采用MTT法分析了不同濃度的高菜硫苷提取物對HCT116 細胞的抑制研究，結(jié)果顯示高菜硫苷提取物作用細胞48 h，其IC50為81.1 μg/μL，因此，選擇50、100、150 μg/μL質(zhì)量濃度梯度的高菜硫苷提取物進行HCT116細胞周期和凋亡預(yù)實驗，預(yù)實驗結(jié)果表明，高菜硫苷提取物濃度為150 μg/μL時，對HCT116細胞周期和凋亡的影響最大，與對照組相比，各時期細胞數(shù)量和凋亡數(shù)量差異明顯，因此，以下細胞實驗選用高菜提取物質(zhì)量濃度為150 μg/μL進行重點分析，以研究高菜硫苷提取物對HCT116結(jié)腸癌細胞的抗增殖、促凋亡作用及其機理。

2.4.1 高菜硫苷提取物對HCT116細胞周期阻滯的效果

高菜硫苷提取物（150 μg/μL）對HCT116細胞周期分析實驗結(jié)果見圖9A、B，經(jīng)分析整理得到細胞周期定量分析結(jié)果如圖9C所示，與對照組相比，高菜硫苷提取物處理的HCT116細胞，G0/G1期的細胞數(shù)量增加了7.26%，S期的細胞數(shù)量減少了20.83%，G2/M期的細胞數(shù)量增加了13.56%，可見，高菜硫苷提取物主要是通過阻滯HCT116細胞S期實現(xiàn)抑制細胞增殖的作用。

圖9 高菜硫苷提取物對結(jié)腸癌HCT116細胞周期的影響Fig.9 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on cell cycle of HCT116 cells

2.4.2 高菜硫苷提取物誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡的效果

細胞凋亡會導(dǎo)致與細胞死亡相關(guān)聯(lián)的生化和形態(tài)學(xué)特征變化[41]。流式細胞儀雙染色法檢測HCT116細胞凋亡情況如圖10A、B所示，經(jīng)過分析整理得到細胞凋亡定量分析結(jié)果如圖10C所示。圖10A、B中各個象限表示處于不同狀態(tài)的細胞：左上象限Q1表示死亡的細胞，右上象限Q2表示晚期凋亡細胞，左下象限Q3表示正常細胞，右下象限Q4表示早期凋亡細胞。與對照組相比，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）處理的HCT116細胞的凋亡比例增加了16.5%，早期凋亡細胞從8.7%增加到15.4%，晚期凋亡細胞從12.3%增加到28.3%，結(jié)果表明高菜硫苷提取物可以通過促進凋亡來抑制HCT116細胞的生長。

圖10 高菜硫苷提取物對結(jié)腸癌HCT116 細胞凋亡的影響Fig.10 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on apoptosis of HCT116 cells

2.5 高菜硫苷提取物對HCT116細胞周期和凋亡相關(guān)mRNA及蛋白的影響

圖11 高菜硫苷提取物對結(jié)腸癌HCT116細胞周期和凋亡相關(guān)mRNA及蛋白的影響Fig.11 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on mRNA and proteins related to cell cycle and apoptosis in HCT116 cells

細胞周期蛋白B、D1、E（Cyclin B、D1、E）在調(diào)節(jié)細胞周期（G1到S期）中起到重要作用[42]，半胱天冬酶（Caspase-3）在細胞凋亡中起著不可替代的作用，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Caspase-3激活伴隨著裂解半胱天冬酶（Cleaved caspase-3）的產(chǎn)生，這常被看作細胞凋亡的一個重要指標[43]。細胞周期及凋亡基因調(diào)控細胞相應(yīng)的蛋白行為，繼而引起細胞周期阻滯甚至凋亡。如圖11A所示，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）處理細胞后，Cyclin B、D1、E的mRNA水平與對照組相比，分別降低了20%、50%、30%，細胞凋亡相關(guān)的Caspase-3和Cleaved caspase-3的mRNA水平與對照相比，分別增加到3 倍和1.2 倍。如圖11B所示，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）處理細胞后，Cyclin B、D1、E的蛋白水平分別降低了31%、23%、50%，與細胞凋亡相關(guān)的蛋白Caspase-3和Cleaved caspase-3相比分別增加到2.3 倍和1.9 倍。

3 結(jié) 論

本研究采用70%乙醇提取高菜中硫代葡萄糖苷類物質(zhì)，采用酸性氧化鋁柱層析純化后，用紫外分光光度法檢測，發(fā)現(xiàn)新鮮高菜中總硫苷含量為15.45 mg/g，屬硫苷類物質(zhì)含量較高的蔬菜；高菜總硫苷的提取率為1.545%，高菜硫苷提取物中總硫苷質(zhì)量分數(shù)為73.7%，表明70%乙醇能有效提取高菜中的硫苷類物質(zhì)。通過HPLCQ-TOF-MS技術(shù)處理，結(jié)合相關(guān)文獻報道的硫苷物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，從高菜硫苷提取物中初步解析出2-丙烯基硫苷、4-甲基硫代丁基硫苷和4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷3 種主要的硫苷化合物，3 種硫苷化合物如與標準品進一步比對便可確認，其他硫苷物質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)需要通過其他方法進一步進行分析。采用流式細胞儀、蛋白質(zhì)印跡法和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)高菜硫苷提取物對正常人結(jié)腸成肌纖維細胞CCD-18Co細胞沒有毒性，但通過誘導(dǎo)HCT116細胞周期信號蛋白（Cyclin B、CyclinD1、CyclinE）的下調(diào)導(dǎo)致了S期細胞周期的停滯，而早期和晚期凋亡細胞的增加以及Caspase-3和Cleaved caspase-3基因和蛋白表達水平的同步上調(diào)，誘導(dǎo)了HCT116細胞的凋亡，從而抑制人結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞增殖，可見，高菜硫苷提取物具有抗結(jié)腸癌的活性，但其具體的抗癌機制還需使用結(jié)腸癌小鼠等動物模型進行進一步評估。

綜上所述，高菜屬硫苷類物質(zhì)含量較高的蔬菜，高菜硫苷提取物在一定質(zhì)量濃度下具有顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖和促進HCT116細胞凋亡的作用，有望成為預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的功能性食品原料。