食源性Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的研究進展

林善婷，胡 曉*，李來好，楊賢慶

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081）

鐵離子是構成人體組織和維持正常生理功能所必需的微量營養(yǎng)元素。作為血紅素的組成成分，其參與氧氣轉運和儲存，鐵離子是過氧化氫酶、單胺氧化酶、細胞色素氧化酶等大多數(shù)酶的構成成分，它不僅參與機體細胞代謝，還可維持正常造血功能以及增強神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能，當體內(nèi)缺乏鐵離子時易導致貧血、缺乏食欲、生長遲緩，對于鐵離子缺乏的孕婦易導致早產(chǎn)，增加母嬰死亡風險等[1]。鐵離子缺乏是世界上最常見且普遍的營養(yǎng)缺乏癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，幾乎一半的6～59 個月的兒童以及1/3的育齡婦女患有缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）癥[2]。鐵離子缺乏癥可能由多種原因引起，如膳食鐵離子攝入不足、鐵離子生物利用度不高、某個時期（如女性孕期）對鐵離子的需求量大等[3]。人體中的鐵離子主要來源于日常膳食，而膳食中的許多谷物類主食，如玉米、大米和豆類，通常含有植酸、單寧、肌醇磷酸鹽和多酚，易與鐵離子結合，形成不溶于水的沉淀從而降低鐵離子在體內(nèi)的吸收[4]。此外，金屬離子之間存在相互拮抗作用，能夠降低鐵離子生物利用度[5]。膳食鈣可以以劑量相關的方式顯著減少鐵離子的吸收，即含有少量鐵離子的高鈣飲食個體會出現(xiàn)缺鐵癥[5]。過量的鋅也會降低鐵離子的吸收[6]。因此，為了增加鐵離子的吸收量，彌補其在吸收過程中的損失，降低其缺乏病的發(fā)生率，常使用鐵離子強化劑對食品進行鐵離子強化，但常規(guī)鐵離子強化劑由于性質不穩(wěn)定而易導致食品的顏色、口味和品質特性發(fā)生不利的變化，造成胃腸道疾病[7]。如硫酸亞鐵在加入嬰兒谷物和可可粉[8]時會引起不可接受的顏色變化，在無麩質面包[9]中引起金屬味和黏性變化等。

Fe2＋/Fe3＋結合活性肽是指具有結合鐵離子活性的肽類物質，其與Fe2＋/Fe3＋結合后形成的肽-Fe2＋/3＋結合物，可提高鐵離子在腸道中的溶解度，使鐵離子通過二價金屬離子轉運體1（divalent metal transporter 1，DMT1）轉入細胞內(nèi)，或通過肽轉運途徑和胞吞作用將肽-Fe2＋/3＋結合物轉運到細胞內(nèi)，促進腸道對鐵離子的吸收，進而起到補鐵的作用；此外，肽-Fe2＋/3＋結合物具有轉運速率快、穩(wěn)定性高、不易被飽和、可減少金屬間的拮抗作用等優(yōu)點[10]。隨著越來越多具有促進或增強鐵離子生物利用度的Fe2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物被研究并鑒定，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物在鐵離子缺乏的調(diào)控中已顯示出潛在的應用價值。Fe2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物作為鐵離子的膳食補充劑已成為研究的熱點。

1 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的來源

目前，根據(jù)現(xiàn)有的研究總結發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽的來源主要有植物蛋白源、陸生動物蛋白源以及水產(chǎn)蛋白源。植物性蛋白是日常膳食中最常見的優(yōu)質蛋白質之一。Lü Ying等[11]利用大豆蛋白水解物經(jīng)固定化金屬親和層析色譜（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）-Fe3＋分離出了富含Glu和Pro的Fe3＋結合活性肽Asp-Glu-Gly-Glu-Gln-Pro-Arg-Pro-Phe-Pro-Phe-Pro-Arg-Pro。Torres-Fuentes等[12]從鷹嘴豆蛋白水解物中分離出了His含量高、可增加Fe2＋溶解度和生物利用度的Fe2＋結合活性肽。Lü Ying等[13]利用核桃蛋白水解物，通過IMAC-Fe3＋分離出了核桃Fe3＋結合活性肽Leu-Ala-Gly-Asn-Pro-Asp-Asp-Glu-Phe-Arg-Pro-Gln和Val-Glu-Asp-Glu-Leu-Val-Ala-Val-Val。Budseekoad等[14]從綠豆蛋白水解物分離鑒定出了肽序列為Pro-Ala-Ile-Asp-Leu的Fe2＋結合活性肽。

陸生動物蛋白也是制備Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的良好來源。Storcksdieck等[15]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬體外胃腸道消化，對煮熟的牛肉、雞肉、鱈魚、羊肉和豬肉等肌原纖維蛋白進行酶解，分離出分子質量約為2 kDa且富含Glu和Asp的Fe2＋結合活性肽。Lee等[16]從豬血漿蛋白水解物中分離鑒定出了Fe2＋結合活性肽Asp-Leu-Gly-Glu-Gln-Tyr-Phe-Lys-Gly。Palika等[17]模擬體外胃腸消化，從蛋清蛋白中分離鑒定出了可結合Fe3＋的磷酸肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln。紀曉雯等[18]利用酪蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)IMAC及質譜（mass spectrometry，MS）法分離鑒定出了Fe2＋結合活性肽His-Ile-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg、Ile-Thr-Val-Asp-Asp-Lys-His-Tyr-Gln-Lys和Thr-Arg-Leu-His-Pro-Val-Gln-Glu-Arg。Li Bo等[19]從鴨蛋蛋白的中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中分離鑒定出Fe2＋結合活性肽Pro-Val-Glu-Glu和Arg-Ser-Ser。

除了利用陸生動植物蛋白制備活性肽外，以低值水產(chǎn)品或水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料制備活性肽也是目前研究的熱點，可提高低值水產(chǎn)蛋白的利用率。Guo Lidong等[20-21]從阿拉斯加鱈魚皮膠原蛋白的胰蛋白酶水解產(chǎn)物中分離出了可結合Fe2＋的三肽Ser-Cys-His以及Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly。相似地，Wu Wenfei等[22]從太平洋鱈魚皮膠原蛋白的胰蛋白酶水解物中分離鑒定出了Fe2＋結合活性肽Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg、Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg和Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Arg。林慧敏[23]從帶魚的蛋白水解產(chǎn)物分離出了可結合Fe2＋的三肽His-Tyr-Asp。Wu Haohao等[24]從鳀魚肌肉蛋白的胰蛋白酶水解物中分離并表征了4 條Fe3＋結合活性肽Glu-Leu-Glu-Gly-Glu-Val-Asp-Ala-Glu-Gln-Lys、Glu-Gln-Asp-Thr-Ser-Ala-His-Leu-Glu-Arg-Met-Lys、Ser-(Gly)7-Leu-Gly-Ser-(Gly)2-Ser-Ile-Arg、Ile-(Glu)2-Leu-(Glu)3-Ile-Glu-Ala-Glu-Arg。Kim等[25]從螺旋藻蛋白水解物中分離鑒定了分子質量為802 Da的Fe2＋結合活性肽Thr-Asp-Pro-Ile(Leu)-Ala-Ala-Cys-Ile(Leu)。

對已分離鑒定出的食物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的肽鏈中基本上含有一個或多個Glu、Pro、Leu、Asp、Val等氨基酸。在陸生動物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的氨基酸序列中，與植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽相比，相同的是二者基本上含有一個或多個Glu、Pro、Leu、Asp，不同的是陸生動物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽還富含Lys、His和Ser。水產(chǎn)蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽與陸生動植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽相比，其同樣含有Glu、Pro、His，但水產(chǎn)蛋白源Fe2＋/Fe3＋結合活性肽還富含Gly，尤其是在鳀魚Fe3＋結合活性肽[24]中，Glu和Gly含量占肽鏈氨基酸總數(shù)的60%及以上。由此可知，以上這些氨基酸在Fe2＋/Fe3＋結合活性中起著重要的作用。

2 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的制備、分離及結構鑒定

2.1 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的制備

酶解法是目前較為常用且獲得生物活性肽安全有效的方法，酶解反應過程易控、條件溫和、無有害物質產(chǎn)生，能制備特定的易于分離的活性肽[26]。目前常用的食品級別商業(yè)酶有風味酶、中性蛋白酶、Alcalase、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α/β-胰凝乳蛋白酶、復合蛋白酶等。Lee等[16]利用風味酶酶解豬血漿蛋白，其酶解物的Fe2＋結合能力為質量濃度1 000 mg/L的酶解物，可溶性Fe2＋質量濃度為26.6 mg/L。Guo Lidong等[20]利用胰蛋白酶酶解鱈魚皮膠原蛋白，酶解物經(jīng)IMAC及反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatogram，RP-HPLC）純化后得到Fe2＋結合活性肽，其Fe2＋結合率為（27.7±1.9）%。Wu Haohao等[24]以鳀魚蛋白為原料，以水解度和Fe3＋結合率為指標，從6 種商業(yè)蛋白酶中篩選出胰蛋白酶為最佳酶，且酶解產(chǎn)物Fe3＋結合率的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）為（0.013±0.001）mg/mL。此外，在雙酶系統(tǒng)中，Palika等[17]模擬體外胃腸消化，先后使用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解蛋清以制備可結合Fe3＋的磷酸肽，經(jīng)過RP-HPLC純化后的酶解產(chǎn)物，其Fe3＋的結合能力顯著高于原始酶解產(chǎn)物。相似地，Torres-Fuentes等[12]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對鷹嘴豆蛋白進行酶解，并從酶解產(chǎn)物中分離出了His含量高的Fe2＋結合活性肽，其經(jīng)IMAC純化后組分的Fe2＋結合能力是原始酶解產(chǎn)物的4.5 倍。

由上可知，胰蛋白酶是制備Fe2＋/Fe3＋結合活性肽最為常用的酶。不同的酶具有不同的酶切位點，酶解蛋白后產(chǎn)生的不同肽段表明其活性不同。胰蛋白酶作為肽鏈內(nèi)切酶，主要作用于肽鏈中Arg或Lys殘基的羧基端。因此，根據(jù)不同的原料，選擇其最優(yōu)的酶或酶組合來制備具有特定活性的目標肽。

2.2 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的分離與結構鑒定

IMAC-Fe2＋/IMAC-Fe3＋分離色譜對Fe2＋結合活性肽和Fe3＋結合活性肽具有高選擇性，在溫和的非變性洗脫條件下使多肽與固定配體之間形成特異性可逆復合物，從而將目標組分與其他組分分開，是Fe2＋/Fe3＋結合活性肽純化的第一階段[27]。已有研究表明核桃蛋白[13]、乳清蛋白[28]、鳀魚肌肉蛋白[24]、鱈魚皮膠原蛋白[21]等水解物經(jīng)IMAC-Fe2＋/IMAC-Fe3＋色譜分離后可獲得Fe2＋/Fe3＋結合活性肽。超濾（ultrafiltration，UF）、離子交換色譜（ion-exchange chromatography，IEC）、凝膠色譜（gel filtration chromatography，GFC）等利用不同的分離原理對多肽進行中間階段的分離。RP-HPLC具有分離速率快、純度高的特點，能夠用于多肽序列鑒定前的純化。多肽被純化后利用MS法來鑒定肽鏈的氨基酸序列，為人工合成多肽提供依據(jù)。Lü Ying等[11]利用UF、IMAC-Fe3＋、RP-HPLC及基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）從大豆蛋白水解物中分離出Fe3＋結合活性肽。核桃蛋白水解物依次經(jīng)過IMAC-Fe3＋、GFC-HPLC、RP-HPLC和液相色譜電離串聯(lián)質譜（liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）等純化與鑒定的步驟后可獲得Fe3＋結合活性肽[13]。Wu Haohao等[24]利用GFC、IMAC-Fe3＋、RP-HPLC、MALDI-TOF-MS/MS從鳀魚蛋白水解物中分離鑒定出了Fe3＋結合活性肽。鱈魚皮膠原蛋白水解物經(jīng)過IMAC-Fe2＋、凝膠色譜-快速蛋白液相色譜（gel filtration chromatography-fast protein liquid chromatography，GFC-FPLC）、RP-HPLC及LC-ESI-MS/MS的純化鑒定步驟后可獲得Fe2＋結合活性肽[21]。

上述研究表明，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽的分離與結構的鑒定需將以上多個方法聯(lián)合使用，精確的鑒定出活性肽的氨基酸序列，為后期人工合成活性肽并進一步探究合成肽的生物活性，進而為實現(xiàn)活性肽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

3 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的結構特征

3.1 分子質量

不同分子質量的Fe2＋/Fe3＋結合活性肽，其結合Fe2＋/Fe3＋的活性不同。小分子質量的鱈魚皮膠原蛋白水解物（345 Da）[20]和螺旋藻蛋白水解物（802 Da）[25]均顯示出比其大分子質量的水解物更高的Fe2＋結合活性。鷹嘴豆蛋白水解產(chǎn)物中小分子質量（＜500 Da）的組分，其Fe2＋結合活性高于大分子質量的組分[12]。從豬血漿蛋白水解物中鑒定出的Fe2＋結合活性肽分子質量為1 055 Da[16]，從核桃蛋白水解物中分離鑒定的兩條Fe3＋結合活性肽的分子質量分別為971.508 0 Da和1 357.648 0 Da[13]。然而，一些大分子質量的肽由于含有特殊氨基酸，且齒狀區(qū)域的數(shù)量較多，可能具有更強的Fe2＋/Fe3＋結合能力[29]。來自鳀魚肌肉蛋白的兩種Fe3＋結合活性肽，其分子質量分別為7 594 Da和8 106 Da[24]。Seth等[30]發(fā)現(xiàn)大部分Fe2＋與大于10 kDa的雞肌肉蛋白肽結合，只有10%的Fe2＋與小肽或氨基酸結合。

由此可知，大部分研究表明分子質量小于1 500 Da的多肽，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性較高，但也有一些分子質量較大的多肽，其Fe2＋/Fe3＋結合活性也較高，因此，多肽分子質量的大小與Fe2＋/Fe3＋結合活性之間的關系還需進一步探究。

3.2 氨基酸組成

每個氨基酸都有兩個有效的供體基團（氨基和羧基），它們可結合金屬離子[31]。根據(jù)路易斯規(guī)則，充當路易斯酸的Fe2＋/Fe3＋可以與富含氧或富含氮的基團（路易斯堿）反應，F(xiàn)e2＋會優(yōu)先與含氮基團（如Arg和Asn）結合，而Fe3＋更傾向于與含氧基團結合，如Glu和Asp中的羧基和磷酸基團[32]。此外，氨基酸側鏈上的R基團通過改變氨基和羧基的化學環(huán)境來影響鐵離子結合物的形成，例如組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基參與Fe2＋/Fe3＋的結合[20]。肽鏈中的Glu、Asp、His、Ser和Cys被報道為可與Fe2＋/Fe3＋結合的氨基酸，即Ser的磷酸基、Asp和Glu的羧基、His的咪唑基以及肽鏈中的Cys都可與Fe2＋/Fe3＋結合[13]。Guo Lidong等[20]從鱈魚皮膠原蛋白中分離鑒定出只含有His、Ser和Cys的Fe2＋結合活性肽（Ser-Cys-His）。紀曉雯等[18]分離出的酪蛋白Fe2＋結合活性肽富含Glu、Asp、Gln。鷹嘴豆蛋白水解物中的His含量與Fe2＋結合活性正相關[12]。甘蔗酵母蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)IMAC-Fe3＋分離后的組分比原來的組分顯示出更高的His、Lys和Arg含量[33]。Budseekoad等[14]發(fā)現(xiàn)Pro-Ala-Ile-Asp-Leu與Fe2＋結合的能力可能與肽鏈中的Pro、Asp和Leu中的吡咯烷環(huán)、羧基和烷基的協(xié)同效應有關。

綜上所述，大多研究顯示具有Fe2＋/Fe3＋結合活性的肽鏈中基本都含有一個或幾個Glu、Asp、His、Ser、Cys和Lys等氨基酸（表1）。

4 肽-Fe2＋/3＋結合物的形成及結合位點

Fe2＋/Fe3＋結合活性肽是一種具有結合Fe2＋/Fe3＋能力的肽類物質，其與Fe2＋/Fe3＋結合后形成肽-Fe2＋/3＋結合物。肽-Fe2＋/3＋結合物中鐵離子主要來源于無機鐵離子，如硫酸亞鐵、氯化亞鐵和氯化鐵[10,28,34]。多肽是兩性物質，其與鐵離子的配位結合受反應時間、溫度、pH值、底物反應比例等因素的影響，且肽鏈具有二級結構和立體空間結構，其發(fā)生配位結合反應后可能對肽鏈的構象產(chǎn)生影響。

4.1 影響肽-Fe2＋/3＋結合物形成的因素

肽與Fe2＋/Fe3＋的結合率及肽-Fe2＋/3＋結合物的穩(wěn)定性受多種因素的影響。肽與Fe2＋/Fe3＋的結合反應是配位體取代水分子的快速反應，通常在室溫條件下，40～60 min內(nèi)即可反應完全[35-36]。而在一定酸堿性范圍內(nèi)，隨著pH值升高，肽與Fe2＋/Fe3＋結合率升高，當pH＞7時結合率降低，即結合反應的最佳pH值為5～6[35]。因為在酸性條件下，H＋易與Fe2＋/Fe3＋競爭供電子基團，不利于肽-Fe2＋/3＋結合物的生成。而在堿性條件下，羥基易與供電子基團爭奪Fe2＋/Fe3＋而形成氫氧化物沉淀；此外，肽與Fe2＋/Fe3＋的比例也會影響肽-Fe2＋/3＋結合物的量，當溶液中Fe2＋/Fe3＋的濃度超過多肽的負載能力時，未與多肽結合的Fe2＋/Fe3＋因水解而導致鐵氫氧化物沉淀的產(chǎn)生，同時會吸附一部分肽-Fe2＋/3＋結合物并與之共同沉淀[35]。Palika等[17]發(fā)現(xiàn)源自蛋清蛋白的合成肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln，其Fe3＋結合活性以劑量依賴性增加，并且以1∶1的物質的量之比飽和。酪蛋白肽與FeCl2·4H2O的質量比例為4∶1時，形成肽-Fe2＋結合物的數(shù)量最多[18]。在花椒籽蛋白肽-Fe2＋結合物[35]和鱈魚皮膠原蛋白肽-Fe2＋結合物中[36]，多肽與FeCl2結合的最佳質量比例分別為2.5∶1和4∶1。段秀等[37]研究發(fā)現(xiàn)在羅非魚膠原蛋白肽與Fe2＋結合反應中，肽與Fe2＋的最佳質量比例為500∶1。原洪等[35]利用單因素試驗與正交試驗研究發(fā)現(xiàn)影響花椒籽多肽與Fe2＋結合率的因素從高到低為：pH值＞肽與FeCl2質量比＞溫度＞時間。此外，李玉珍等[38]利用單因素試驗及Box-Behnken響應面優(yōu)化技術研究發(fā)現(xiàn)，花生粕蛋白多肽與Fe2＋的最佳結合條件為：m多肽∶在此條件下肽與Fe2＋的結合率為（85.68±1.27）%。

表1 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的來源、制備條件及氨基酸序列Table 1 Sources, preparation conditions and amino acid sequences of Fe2＋/Fe3＋chelating peptides

由上總結發(fā)現(xiàn)，不同的原料制備出不同的Fe2＋/Fe3＋結合活性肽，其與Fe2＋/Fe3＋的最佳結合條件也會有差異，尤其是在肽與Fe2＋/Fe3＋的結合比例上差異較大。

4.2 肽-Fe2＋/3＋結合物的結合位點和結構變化

紫外-可見光譜（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、MS以及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技術常用來分析肽-Fe2＋/3＋結合物的結合位點以及肽-Fe2＋/3＋結合后結構的變化。Huang Guangrong等[39]通過FTIR發(fā)現(xiàn)蝦加工副產(chǎn)物水解產(chǎn)物的Fe2＋結合的位點主要對應于羧酸酯基團，在較小程度上對應于肽鍵。Chen Qianru等[40]研究利用MS/MS技術發(fā)現(xiàn)Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly中His的咪唑環(huán)可能是潛在的Fe2＋結合位點。Eckert等[34]利用MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr中的Val和Leu參與了Fe2＋結合，Pro殘基沒有直接參與Fe2＋的結合，而是使肽鏈彎曲形成結合環(huán)，肽鏈中的-Val-Pro-Leu和Tyr殘基可能是Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr的Fe2＋結合位點。林慧敏[23]利用NMR及FTIR結構表征顯示，肽鏈His-Tyr-Asp中的—NH—、—NH2以及末端—COOH上的C＝O及—OH與Fe2＋發(fā)生結合，形成不穩(wěn)定的結合物。肽與Fe2＋/3＋發(fā)生結合反應后，可能會引起肽鏈結構的變化，Wu Haohao等[41]發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白鐵離子結合活性肽myosin1116-1127側鏈的羧基是Fe3＋的結合位點，即肽鏈羧基結合Fe3＋形成COO-Fe，再水解形成COO-Fe(OH)n，最后脫水縮合完成晶體生長，該過程中肽鏈的氫鍵體系遭到破壞，二級結構由β-折疊變?yōu)闊o規(guī)卷曲。段秀等[37]也發(fā)現(xiàn)羅非魚皮膠原蛋白肽與Fe2＋結合后，熒光強度降低，即肽與Fe2＋的結合過程中伴隨著肽鏈的折疊，相似的結果在鳀魚多肽與Fe3＋的結合過程中也有發(fā)現(xiàn)[24]。

綜上，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽中Fe2＋/Fe3＋的結合位點主要是羧基與羰基等含氧基團、氨基等含氮基團以及His的咪唑基，肽鏈與Fe2＋/Fe3＋結合過程伴隨肽鏈折疊等結構的變化（表2）。

表2 肽-Fe2＋/3＋結合物的結合條件及結合位點Table 2 Chelating conditions and sites of peptide-Fe2＋/3＋complexes

5 Fe2＋/Fe3＋結合活性肽與肽-Fe2＋/3＋結合物的生物活性

5.1 促進Fe2＋/Fe3＋的吸收

Caco-2細胞模型常用于評估Fe2＋/Fe3＋的體外吸收研究。Garcia-Nebot等[43]研究證明了β-CN（125）4P、αs1-CN（64-74）4P和αs2-CN（1-19）4P肽可增加Caco-2細胞中鐵蛋白的合成。Chen Qianru等[40]發(fā)現(xiàn)源自鱈魚皮的Fe2＋結合活性肽Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly在Caco-2細胞中可促進Fe2＋的轉運。Palika等[17]研究發(fā)現(xiàn)人工合成的蛋清Fe3＋結合活性肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln增加了Fe3＋在Caco-2細胞中的攝取量并刺激Caco-2細胞中鐵蛋白的合成。Wu Haohao等[10]研究發(fā)現(xiàn)鳀魚肌肉蛋白肽-Fe3＋結合物通過肽轉運途徑以及DMT1途徑促進Caco-2細胞對Fe2＋/Fe3＋的吸收。Caco-2細胞模型用于研究Fe2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物的體外促進Fe2＋/Fe3＋吸收效果，而IDA大鼠模型則用于評估肽-Fe2＋/3＋結合物在動物體內(nèi)的生物利用度。研究發(fā)現(xiàn)鴨蛋蛋白肽-Fe2＋結合物[19]可使IDA大鼠的體質量、器官系數(shù)和血液學參數(shù)恢復到正常水平，上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白（hepcidin，Hepc）的表達，并通過下調(diào)細胞頂膜的Fe2＋轉運蛋白DMT1以及細胞基底膜的鐵轉運蛋白的表達來調(diào)節(jié)鐵離子代謝，表明DPs-Fe2＋可作為潛在的Fe2＋補充劑。此外，F(xiàn)e2＋-β酪蛋白磷酸肽也被證實可提高缺鐵大鼠體內(nèi)Fe2＋的凈吸收量[44]。

在比較肽-Fe2＋/3＋結合物與其他補鐵產(chǎn)品的促鐵吸收效果中，Eckert等[34]研究發(fā)現(xiàn)大麥蛋白肽-Fe2＋結合物與FeSO4相比，可顯著增加Caco-2細胞對Fe2＋攝取量，且經(jīng)胃蛋白酶-胰酶消化后的Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr-Fe2＋結合物可使Caco-2細胞對Fe2＋的攝取量提高4 倍。相似地，乳清蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，小分子質量的肽與Fe2＋形成的結合物與FeSO4相比，其在Caco-2細胞中的Fe2＋攝取量增加了約70%[28]。同時，Ma Xiaoming等[45]通過構建IDA大鼠評價模型發(fā)現(xiàn)鱈魚骨骼蛋白肽-Fe2＋結合物不僅可使IDA大鼠的體質量、身高和血液參數(shù)恢復到正常水平，且其與FeSO4相比還能更有效地改善IDA大鼠的血紅蛋白、血清鐵離子和轉鐵蛋白的水平，恢復鐵離子與轉鐵蛋白的結合能力。Xiao Chen等[46]研究發(fā)現(xiàn)高劑量的Arg-Glu-Glu-Fe2＋與FeSO4、Fe-Gly相比，可顯著提高IDA大鼠的腎系數(shù)、總鐵結合能力、上調(diào)轉鐵蛋白水平以及肝臟中Hepc信使RNA的表達水平，并且與正常對照組相比無顯著性差異。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)灌流的大鼠腸環(huán)模型中，源于β-酪蛋白的酪蛋白磷酸肽-鐵結合物的吸收效果優(yōu)于葡萄糖酸鐵[47]。上述研究結果表明，肽-Fe2＋結合物是比FeSO4、Fe-Gly和葡萄糖酸鐵更為有效的鐵離子補充劑。

盡管Fe2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物在Caco-2細胞實驗及IDA大鼠實驗中均顯示出促進Fe2＋/Fe3＋的吸收，但若要將其制成商品化的膳食Fe2＋/Fe3＋補充劑，還需研究其在人體中確切的吸收機制及吸收利用效果。已有研究表明，蛋白質、氨基酸[48]以及肉在消化過程中可生成含Cys的肽，其對人體Fe2＋的吸收有促進作用[49]。Martinez-Torres等[50]發(fā)現(xiàn)當Cys與植物性食物攝入時，非血紅素鐵在人體中的吸收有所增強。Layrisse等[48]研究了His、Cys、谷胱甘肽和牛肉對人體Fe2＋吸收的影響，結果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽顯著增加了黑豆和玉米中非血紅素以及血紅蛋白中血紅素Fe2＋的吸收；此外，Cys、谷胱甘肽對玉米中Fe2＋的吸收增強作用與牛肉相似。然而，Pizarro等[51]研究發(fā)現(xiàn)動物源蛋白質及其消化產(chǎn)物不會增強人體血紅素Fe2＋的吸收。因此，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物在人體中如何促進Fe2＋/Fe3＋的吸收有待進一步深入研究。

5.2 其他活性

Fe2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-鐵結合物的主要作用是促進鐵離子在人體中的吸收，除此之外，它們還具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等活性。在Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的活性研究中，趙聰?shù)萚52]研究發(fā)現(xiàn)灰樹花蛋白Fe2＋結合活性肽具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基的能力，隨著活性肽質量濃度的增加，其自由基的清除率明顯增加，在活性肽質量濃度為4 mg/mL時，其DPPH自由基和羥自由基的清除率分別高達92%和99.5%，且活性肽對于DPPH自由基的清除能力高于VC溶液。在肽-鐵結合物的活性研究中，林慧敏[23]研究發(fā)現(xiàn)帶魚下腳料水解物的Fe2＋結合物具有抗菌活性，可抑制金黃色葡萄球菌對數(shù)生長期的菌體分裂，影響細菌細胞膜的滲透性，抑制金黃色葡萄球菌腸毒素A的分泌。Kholnazarov等[53]發(fā)現(xiàn)Ile-Trp-Fe2＋結合物具有免疫調(diào)節(jié)作用。此外，Zhang Bin等[54]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂了400～1 000 mg/kg帶魚蛋白水解物-Fe2＋結合物的克氏原螯蝦，其成活率、增質量比例、比生長率、肌肉指數(shù)以及血清和肝胰臟中的超氧化物歧化酶、酚氧化酶、溶菌酶和酸性磷酸酶的活力與對照組相比均顯著提高，即PH-Fe2＋可作為克氏原螯蝦飼料的補充劑，以促進生長和增強免疫力。在活性肽與肽-鐵結合物的活性比較中，Blat等[55]研究發(fā)現(xiàn)Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Fe2＋結合物具有抗氧化活性，可抑制鐵催化的羥自由基的形成和脂質過氧化，其保護人神經(jīng)母細胞瘤細胞免受過氧化氫細胞毒性作用的效果優(yōu)于原多肽。林慧敏等[56]發(fā)現(xiàn)4 種低值魚蛋白酶解肽沒有抑菌活性，而經(jīng)與Fe2＋結合后形成的Fe2＋結合物表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。此外，楊玉蓉等[42]研究發(fā)現(xiàn)小分子質量（＜5 000 Da）的桃仁多肽-Fe2＋結合物抑菌活性高于大分子質量的，且桃仁多肽-Fe2＋結合物和小麥多肽-Fe2＋結合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）均為5.0 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC分別為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL，該研究還發(fā)現(xiàn)桃仁、大豆、玉米和小麥等多肽-Fe2＋結合物的抗菌活性均高于原多肽，據(jù)此推測桃仁多肽Fe2＋結合物的抑菌活性與Fe2＋的抑菌活性有關。

6 肽-Fe2＋/3＋結合物促進Fe2＋/Fe3＋吸收的機制

6.1 提高并保持Fe2＋/Fe3＋的溶解度

所有的營養(yǎng)素均需要處于溶解的狀態(tài)才會被細胞吸收利用。然而，日常膳食中通常含有Fe2＋/Fe3＋吸收抑制劑，如植酸、單寧、草酸鹽和多酚等，它們可結合鐵離子形成沉淀而降低Fe2＋/Fe3＋在腸道中的溶解度[57]。此外，腸腔中的環(huán)境是堿性的，F(xiàn)e2＋/Fe3＋在pH＞3時會形成沉淀。多肽可以結合Fe2＋/Fe3＋形成可溶性的肽-Fe2＋/3＋結合物，使Fe2＋/Fe3＋在小腸中保持可溶狀態(tài)。Wu Haohao等[41]研究發(fā)現(xiàn)，鳀魚多肽介導的Fe3＋納米微粒的形成可提高Fe3＋在溶液中的溶解度。Fe2＋-CPP結合物的形成也提高了Fe2＋在消化道中的溶解度。先后經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的蛋清蛋白，其酶解產(chǎn)物與Fe2＋的結合產(chǎn)物同樣增加了Fe2＋在溶液中的溶解度[17]。蛋白酶解物或肽與Fe2＋/Fe3＋結合后使Fe2＋/Fe3＋以溶解的狀態(tài)進入腸道，進而被腸細胞以胞吞形式、肽轉運途徑或通過胞膜上的離子通道將Fe2＋/Fe3＋攝入腸細胞。

6.2 通過多種途徑促進Fe2＋/Fe3＋的吸收

目前，相關研究發(fā)現(xiàn)肽-Fe2＋/3＋結合物中的Fe2＋/Fe3＋可能通過寡肽轉運體PepT1/PepT2、胞吞和離子通道等途徑進入腸細胞。研究發(fā)現(xiàn)用Fe-Gly飼喂的仔豬，其十二指腸和空腸中PepT1的mRNA表達水平高于飼喂FeSO4的仔豬，從而表明PepT1在Fe-Gly的吸收中起關鍵作用[58]。CPP-Fe2＋結合物可通過胞吞作用被吸收[59]。人體內(nèi)的Fe3＋需經(jīng)還原性物質，如十二指腸細胞色素b（duodenal cytochrome B，Dcytb）以及腸細胞中其他還原酶將Fe3＋還原為Fe2＋后才能發(fā)揮其生理活性[60]。Cys和還原型谷胱甘肽增強了Caco-2細胞中Fe3＋的吸收，但對Fe2＋的吸收沒有影響，這表明它們可能通過還原Fe3＋來促進鐵離子的吸收[61]。同樣地，Wu Haohao等[10]研究發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞通過非特異性、非吸附性的胞吞作用來轉運鳀魚多肽-Fe3＋結合物，并發(fā)現(xiàn)腸細胞膜上的Dcytb還原酶可將Fe3＋還原為Fe2＋，F(xiàn)e2＋再通過腸細胞膜上的Fe2＋轉運蛋白DMT1轉運至細胞內(nèi)，進而促進Fe2＋/Fe3＋的吸收。

綜上，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物促進Fe2＋/Fe3＋吸收的機制為（圖1）：Fe2＋/Fe3＋結合活性肽結合Fe2＋/Fe3＋后可提高并保持Fe2＋/Fe3＋在腸道中的溶解度，當Fe2＋/Fe3＋結合活性肽是小分子寡肽時，小分子寡肽結合Fe2＋/Fe3＋后可能通過PepT1/PepT2途徑將肽-Fe2＋/3＋結合物轉入胞內(nèi)；當較大分子質量的活性肽結合Fe2＋，即形成肽-Fe2＋結合物時，肽-Fe2＋結合物以胞吞的形式或通過胞膜上的Fe2＋轉運蛋白DMT1將Fe2＋攝入細胞內(nèi)；當結合的是Fe3＋時，肽-Fe3＋結合物以胞吞的形式進入腸細胞后，F(xiàn)e3＋可經(jīng)胞內(nèi)的還原性物質還原為Fe2＋，或者腸細胞膜上的Dcytb還原酶將肽-Fe3＋結合物中Fe3＋的還原為Fe2＋后，再通過Fe2＋轉運蛋白DMT1進入細胞內(nèi)，從而促進Fe2＋的吸收。

圖1 肽-Fe2＋/3＋結合物促進Fe2＋/Fe3＋吸收的機制Fig.1 Mechanism of peptide-Fe2＋/3＋complexes for promoting iron absorption

7 結 語

目前，對于Fe2＋/Fe3＋結合活性肽的研究主要是酶解制備、序列鑒定以及基礎活性，而研究鮮少關注于肽與Fe2＋/Fe3＋反應的過程表征。盡管有許多研究利用UV-vis和FTIR推測出Glu、Asp、His等在肽鏈與Fe2＋/Fe3＋結合過程中起重要作用，但其確切的結合位點及結合后結構的變化尚不清楚，應進一步利用MS或分子對接技術對肽與Fe2＋/Fe3＋的結合位點進行準確的定位，對其結合后的結構變化進行表征。肽-Fe2＋/3＋結合物促進Fe2＋/Fe3＋吸收的機制大多只研究肽轉運途徑，鮮有從Fe2＋/Fe3＋細胞膜蛋白轉運通道等其他途徑進行探究，應進一步明確肽-Fe2＋/3＋結合物中Fe2＋/Fe3＋在腸細胞上的吸收通路。此外，肽-Fe2＋/3＋結合物還面臨著如何維持其自身穩(wěn)定性以及在胃腸道中的穩(wěn)定性等關鍵性問題。Fe2＋/Fe3＋補充劑在長期貯存和加工過程中可能會發(fā)生許多未知的變化，如鐵酪蛋白琥珀?；后w口服制劑在長期貯存后會產(chǎn)生不可接受的味道[62]。因此，需進一步研究肽-Fe2＋/3＋結合物與不同食物基質的相容性，以及其在胃腸道消化或長期貯存過程中的穩(wěn)定性。目前，盡管大多數(shù)Fe2＋/Fe3＋結合活性肽或肽-Fe2＋/3＋結合物已被證明對動物或細胞具有促進Fe2＋/Fe3＋吸收作用，但還亟需進一步確認其在人體中的實際應用效果。

多肽可作為營養(yǎng)素，為人體提供所需的氨基酸，其與Fe2＋/Fe3＋結合后還可促進非血紅素Fe2＋/Fe3＋的吸收，減少Fe2＋/Fe3＋缺乏癥的危害。此外，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物的原料大多是食物蛋白質，原料來源安全且資源豐富，既能充分利用蛋白資源還能避免浪費和環(huán)境污染。隨著研究的深入，F(xiàn)e2＋/Fe3＋結合活性肽及肽-Fe2＋/3＋結合物作為促鐵離子吸收劑將具有廣闊的應用前景。