吳禮婷 伍清華 彭 芳 洪 瑋

1.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院ICU科，廣東廣州 511436；3.廣州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 511436

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以小氣道呼氣受阻為主要特征的慢性進(jìn)行性疾病，主要病理特征為慢性支氣管炎（氣道損傷、重塑）和肺氣腫（肺組織彈力纖維破壞）。COPD的發(fā)病機(jī)制與炎癥細(xì)胞密切相關(guān)，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）等。另外，還與蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡、氧化應(yīng)激、自身免疫機(jī)制及細(xì)胞衰老等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡使肺的組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞破壞程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其自身的正常生長(zhǎng)，從而促進(jìn)了COPD的發(fā)生發(fā)展[1-3]。凋亡學(xué)說(shuō)對(duì)肺泡間隔的結(jié)構(gòu)細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，參與了肺氣腫的發(fā)病機(jī)制，其中尤以肺泡上皮細(xì)胞的凋亡致肺氣腫形成備受關(guān)注[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）能夠誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞的凋亡，這是目前COPD發(fā)病機(jī)制研究的重要內(nèi)容[6]。ERS發(fā)生的關(guān)鍵因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），在有害刺激程度較輕時(shí)可以對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，當(dāng)有害刺激程度加重或持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，GRP78對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞的保護(hù)作用喪失，該因子下游的ERS致細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路被激活，細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)，最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異凋亡分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白-12（cysteinyl aspartatespecific proteinase-12，caspase-12）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/C/EBP homologous protein，CHOP）表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-9]。有研究表明，PI3K/Akt通路能夠通過(guò)對(duì)抑制生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153（growth arrest and DNA damage-inducible gene153，GADD153）的誘導(dǎo)，從而對(duì)ERS細(xì)胞起保護(hù)作用[10]。PI3K/Akt通路也可通過(guò)對(duì)ERS誘導(dǎo)GRP78表達(dá)增加發(fā)揮保護(hù)作用。研究表明，配體酪氨酸激酶受體系統(tǒng)是PI3K/Akt通路的激活劑[11]。Lyn激酶是非受體酪氨酸激酶Src家族成員，Lyn激酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、代謝與免疫反應(yīng)等過(guò)程中起著重要的作用。此外，Lyn激酶與多種信號(hào)途徑相關(guān)聯(lián)，在很多組織細(xì)胞中有正向或負(fù)向的調(diào)節(jié)作用[12-14]。有研究表明，在肺功能的危重癥COPD患者中均可檢測(cè)到Lyn基因的出現(xiàn)，但與Lyn激酶在COPD的發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制相關(guān)的報(bào)道較少[15]。體內(nèi)缺乏Lyn激酶的小鼠（Lyn -/-小鼠）表現(xiàn)出顯著升高的白細(xì)胞介素-17（interlukin-17，IL-17）和干擾素γ（interferon gama，IFN-γ）[16]。IL-17是記憶T細(xì)胞分泌的前炎癥因子，與多種炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)相關(guān)，可以促進(jìn)氣道阻塞的發(fā)生和誘導(dǎo)COPD急性加重，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生和發(fā)展[17]。探討Lyn激酶對(duì)COPD發(fā)生過(guò)程中的作用及其機(jī)制，對(duì)于尋找COPD治療新靶點(diǎn)及新型藥物有重要意義。本文將探討Lyn激酶通過(guò)PI3K/Akt通路對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對(duì)炎癥因子IL-17的調(diào)節(jié)在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生

細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的正常維持與很多機(jī)體環(huán)境因素有關(guān)，包括營(yíng)養(yǎng)不良、糖基化修飾作用的改變、缺血再灌注損傷、鈣缺乏、氧化應(yīng)激、DNA損傷和能量不足等情況[18]。生理性蛋白質(zhì)折疊量增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)的功能紊亂，出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，即為ERS。當(dāng)應(yīng)激發(fā)生后，ERS的關(guān)鍵因子GRP78表達(dá)上調(diào)，蛋白質(zhì)合成被抑制、錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)加速降解，從而使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷工作得以緩解，可暫緩ERS[19]。當(dāng)ERS異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的發(fā)生，從而保護(hù)細(xì)胞。UPR的下游有三種跨膜蛋白，即蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase， PERK）、肌醇激酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6， ATF6）[20]。在細(xì)胞生理功能正常時(shí)，這三種跨膜蛋白處于無(wú)活性狀態(tài)，分別與GRP78結(jié)合。當(dāng)出現(xiàn)ERS時(shí)，上述3種蛋白質(zhì)與GRP78解離，與未折疊蛋白結(jié)合從而啟動(dòng)UPR。UPR啟動(dòng)后，PERK、IRE-1、ATF6與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)減少，使其負(fù)荷減輕并恢復(fù)正常功能，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[21]。嚴(yán)重的刺激引起程度過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的ERS反應(yīng)時(shí)，損傷超過(guò)修復(fù)能力，UPR不能啟動(dòng)，PERK、ATF6和IRE-1未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的結(jié)合量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，此時(shí)PERK、ATF6和IRE-1會(huì)啟動(dòng)凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與之相應(yīng)凋亡機(jī)制包括：①DNA損傷誘導(dǎo)基因153（GIDD153）的激活轉(zhuǎn)錄；②C.Jun氨基酸末端激酶（C-Jun N.terminalkinase）通路的激活；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的激活等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)PERK/eIF2、ATF6和IREl/XBP1信號(hào)途徑均被激活，并且誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)。CHOP基因抑制轉(zhuǎn)錄因子C/EBP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶1（ERAP1）的表達(dá)，可抑制細(xì)胞周期過(guò)程中從G1到S期的轉(zhuǎn)換。CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可以介導(dǎo)GADD34和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化物蛋白（endoplasmic oxidoreductin 1 like protein，Ero-Lα）的激活與表達(dá)。GADD34可以使真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化真核啟動(dòng)因子2α抗體（Ser51）去磷酸eIF2α的Ser51去磷酸化，刺激蛋白的合成。Ero-Lα可以引起氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞中缺乏CHOP時(shí)，細(xì)胞凋亡下降，CHOP過(guò)表達(dá)則能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CHOP在ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促凋亡作用。J-NK的激活通路可以通過(guò)多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。吸煙可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游PERK/eIF2/CHOP信號(hào)通路促進(jìn)CHOP表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。而ERS的下游PI3K/Akt信號(hào)通路則對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用，從而促進(jìn)COPD的發(fā)生與發(fā)展。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的下游PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化。此外，其本身也具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。PI3K的構(gòu)象改變和其與某些因子結(jié)合會(huì)使其激活。其激活方式如下：①與含有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活。②通過(guò)原癌基因c-ras表達(dá)的產(chǎn)物Ras和催化亞基p110直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K的活化。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K可以使Akt活化。有活性的Akt可以誘導(dǎo)各種編碼抗凋亡蛋白基因表達(dá)或發(fā)生信號(hào)偶聯(lián)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生成[22]。當(dāng)細(xì)胞外沒(méi)有刺激信號(hào)時(shí)，p85調(diào)節(jié)亞基與p110催化亞基與PI3K結(jié)合，此時(shí)的PI3K沒(méi)有活性，當(dāng)機(jī)體損傷致缺血在灌注損傷、鈣缺乏、氧化應(yīng)激、DNA損傷和能量不足等情況時(shí)，調(diào)節(jié)亞基p85與催化亞基p110之間的相互作用受抑制，隨后PI3K/Akt通路激活，活化的Akt通過(guò)磷酸化作用于一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白從而介導(dǎo)下游反應(yīng)[23]。ERS過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，PI3K/Akt通路可能對(duì)ERS存在負(fù)調(diào)節(jié)作用。有研究表明，PI3K/Akt通路能夠通過(guò)對(duì)GADD153的誘導(dǎo)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用[10]。另外，PI3K/Akt通路也可通過(guò)對(duì)ERS誘導(dǎo)GRP78表達(dá)增加中發(fā)揮保護(hù)作用[24]。細(xì)胞處于生理狀態(tài)下時(shí)，GRP78的表達(dá)水平較低，當(dāng)各種刺激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78的表達(dá)量會(huì)顯著增加，表現(xiàn)出保護(hù)細(xì)胞受損的功能[25]。研究表明當(dāng)P13K/Akt信號(hào)通路激活受阻時(shí)，ERS引起的GRP78表達(dá)顯著下降，而上調(diào)P13K/Akt信號(hào)通路活性時(shí)則誘導(dǎo)GRP78表達(dá)，PI3K/Akt通路通過(guò)抑制蛋白酶體，使GRP78蛋白降解，穩(wěn)定性增加，發(fā)揮調(diào)控作用[26]。

3 Lyn激酶是PI3K/Akt通路的激活劑

Lyn激酶是Src家族成員之一，是一類(lèi)非受體型蛋白酪氨酸激酶，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中具有重要作用。Lyn激酶的N末端有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域，C末端有一個(gè)保守酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，主要通過(guò)其N(xiāo)末端與細(xì)胞膜表面蛋白的胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域相連接，從而發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Lyn激酶與其他Src家族激酶成員一樣通過(guò)其N(xiāo)末端SH2/SH3結(jié)構(gòu)域以及磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用[27]。Lyn激酶可通過(guò)多種信號(hào)途徑參與氣道重塑和炎癥反應(yīng)，具有雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)的作用。細(xì)胞內(nèi)缺乏Lyn激酶，可引起氣道高反應(yīng)、氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生。研究表明，配體酪氨酸激酶受體系統(tǒng)是PI3K/Akt通路的激活劑[28]。PI3K不僅具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K可分為3類(lèi)，其結(jié)構(gòu)與功能不同。I類(lèi)PI3K含有1個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基，為異源二聚體，調(diào)節(jié)亞基通常稱(chēng)為p85，含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，與含有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白相作用。Lyn激酶的N基末端含有與之相應(yīng)結(jié)合SH2和SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)，表明Lyn激酶可誘導(dǎo)PI3-K/Akt通路激活。

4 Lyn激酶缺乏誘導(dǎo)IL-17顯著增加

IL-17可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)，COPD多表現(xiàn)為氣道的慢性炎癥，IL-17在COPD發(fā)生的炎癥過(guò)程中起重要作用[29]。IL-17參與COPD肺氣腫表型的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。IL-17可以特異性地和選擇性地將嗜中性粒細(xì)胞募集到氣道中，IL-17對(duì)氣道上皮中黏蛋白基因表達(dá)的影響與黏液產(chǎn)生增加有關(guān)。COPD的病理表現(xiàn)特征為氣道炎癥和黏液分泌過(guò)多，黏液分泌過(guò)多是COPD的病理生理變化之一，IL-17可能在COPD的發(fā)展中起重要作用。在吸入卵白蛋白（OVA）的小鼠中，抗IL-17抗體對(duì)IL-17活性的抑制顯著降低了氣道炎癥細(xì)胞數(shù)量的增加，IL-17可能在小鼠中香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD中的氣道中性粒細(xì)胞炎癥中起關(guān)鍵作用。有研究表明，Lyn -/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎易感性與結(jié)腸T細(xì)胞對(duì)IL-17和IFN-γ的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān)。與空白對(duì)照小鼠相比，免疫活性的Lyn -/-小鼠表現(xiàn)出顯著升高的IL-17和IFN-γ。因此，受共生微生物群影響的腸T細(xì)胞群的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)可使Lyn -/-小鼠易于對(duì)由IL-17和（或）IFN-γ產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)的炎性疾病敏感。從最初的Lyn -/-菌落到已經(jīng)重新獲得的Lyn -/-小鼠的微生物均可檢測(cè)到IFN-γ（+）CD4+和CD8+T細(xì)胞以及IL-17的顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明Lyn的缺乏足以誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IFN-γ增加[30]。Lyn激酶缺乏誘導(dǎo)增多的IL-17在COPD發(fā)生機(jī)制中有重要作用。PI3K/Akt通路也能夠通過(guò)對(duì)GADD153的誘導(dǎo)，對(duì)ERS細(xì)胞起保護(hù)作用。Lyn激酶缺乏一方面可能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17增加，增加的IL-17會(huì)引起肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的募集，引起持續(xù)炎癥反應(yīng)從而加重COPD的慢性炎癥過(guò)程。另一方面Lyn激酶缺乏使ERS下游PI3K/Akt通路不能激活，PI3K/Akt通路對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用不能發(fā)揮，細(xì)胞發(fā)生凋亡，中性粒細(xì)胞在極性化和趨化過(guò)程受阻，中性粒細(xì)胞的免疫防御能力下降均加重COPD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Lyn激酶缺乏在IL-17高表達(dá)的情況下可能抑制PI3K/Akt通路的激活，而激活的PI3K/Akt通路主要通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的GRP78分子表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。PI3K/Akt通路也能夠通過(guò)對(duì)GADD153的誘導(dǎo)，對(duì)ERS細(xì)胞起保護(hù)作用。當(dāng)ERS持續(xù)存在情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度，ERS下游對(duì)細(xì)胞的保護(hù)通路PI3K/Akt通路不能激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，PI3K/Akt通路在中性粒細(xì)胞的極性化和趨化過(guò)程中起重要作用，中性粒細(xì)胞在此過(guò)程中往往表現(xiàn)出免疫防御反應(yīng)，對(duì)COPD病情有一定緩解作用。PI3K/Akt通路不能激活，中性粒細(xì)胞在極性化和趨化過(guò)程受阻，以及IL-17高表達(dá)時(shí)，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集活化，爆發(fā)了一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)了COPD的發(fā)生發(fā)展。