馬燕瑩，張鳳玉，潘 皎

(1. 故宮博物院文?？萍疾?，北京 100009； 2. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系，天津 300071)

0 引 言

大藏經(jīng)，又稱一切經(jīng)、契經(jīng)、藏經(jīng)或三藏，現(xiàn)存的大藏經(jīng)按不同書寫文字可分為漢文、藏文、巴利語三大體系[1]。藏文大藏經(jīng)是翻譯成藏文的印度佛教原典和佛教著述的總集，由甘珠爾和丹珠爾兩大部分組成，藏文大藏經(jīng)絕大部分是手抄本，文字典雅，用筆流暢，部分繪有精美的佛像，具有很高的藝術(shù)價(jià)值，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界公認(rèn)的一部具有百科全書性質(zhì)的藏文古籍叢書，已成為佛學(xué)(尤其是藏傳佛學(xué))和藏學(xué)研究最重要、最基本的資料之一[2]。

甘肅武威亦稱涼州，地處河西走廊東端，自古以來就是多民族聚居區(qū)，古絲綢之路重鎮(zhèn)，是較早從事佛經(jīng)翻譯的地區(qū)[3]。武威作為東西方文化交流的樞紐和佛教?hào)|傳的橋頭堡，在中國(guó)佛教傳播發(fā)展史上占有重要地位[4]。據(jù)2002年出版的《武威民族宗教志》記載：歷史上涼州地區(qū)的藏傳佛教寺院多達(dá)二十余座，至民國(guó)初期尚有22座藏傳佛教寺院[5]。西夏時(shí)期，藏傳佛教在武威得以弘傳，到元明清三代達(dá)到鼎盛[6-7]。武威地區(qū)曾出土大量西夏時(shí)期的紙質(zhì)文書和佛經(jīng)[8]。武威白塔寺也曾發(fā)現(xiàn)明代漢、藏文的紙質(zhì)佛經(jīng)，其中以藏文大藏經(jīng)最為著名[9]。

新中國(guó)成立以后，武威各寺院及藏經(jīng)閣內(nèi)供奉的明清時(shí)期藏文大藏經(jīng)等佛教文獻(xiàn)典籍全部收歸博物館保管。目前，王歡歡等[10]研究發(fā)現(xiàn)武威市博物館館藏藏文大藏經(jīng)紙張?jiān)嫌衼喡椤⑵r麻、棉花及構(gòu)皮纖維，紙張以高嶺土為填料，并經(jīng)靛藍(lán)染色，以天然礦物石墨材料涂敷于紙張表面，經(jīng)文紙張邊框用赤鐵礦繪制，用銀泥書寫經(jīng)文。龔鈺軒等[11]研究認(rèn)為武威市博物館藏藏文大藏經(jīng)的書寫方式主要有硬筆手寫和雕版印刷。這批大藏經(jīng)數(shù)量很大，在修復(fù)過程中，出現(xiàn)了一批用金色文字書寫的經(jīng)文。本工作選取少量脫落的金字大藏經(jīng)破損殘片及粘連大藏經(jīng)微生物樣品，利用光學(xué)顯微鏡觀察、掃描電鏡與能譜法、顯微激光拉曼光譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、微生物分離純化培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)鑒定技術(shù)以及高通量測(cè)序等方法，分析其紙張和文字的成分結(jié)構(gòu)以及紙張表面粘連原因與微生物種類，以期為大藏經(jīng)保護(hù)材料和修復(fù)技術(shù)的選擇提供信息與依據(jù)，也為其揭展和防霉材料篩選提供評(píng)估數(shù)據(jù)。

1 樣品與分析方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

金泥書寫大藏經(jīng)樣品整體保存狀況不佳，紙張纖維老化嚴(yán)重，隱約可見藍(lán)色纖維，表明紙張?jiān)?jīng)過藍(lán)色染料涂染，其上涂覆黑色顏料，并書寫金色文字。樣品表面存在粘連、蟲蛀、褪色等病害。樣品編號(hào)S1見圖1。

圖1 取樣分析之大藏經(jīng)樣品S1Fig.1 Paper sample S1 for analysis

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1) 尼康SMZ-10型體視顯微鏡。

2) 日立公司S-3600N型掃描電子顯微鏡，分析電壓20 kV。美國(guó)EDAX公司Genesis 2000XMS型X射線能譜儀。

3) LC20AD高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)，包括SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)和SIL-20AT自動(dòng)進(jìn)樣器；LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)。

4) 法國(guó)JY公司(現(xiàn)HORIBA公司)XploRA型拉曼光譜儀：配置Olympus BX-41顯微鏡；激光波長(zhǎng)532 nm、638 nm和785 nm。

5) 美國(guó)CLEAN公司pH30酸堿度儀。

6) PCR儀(Eppendorf)、臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)、電泳儀(北京六一儀器廠)、電熱培養(yǎng)箱(上海一恒科技)、高溫高壓蒸汽滅菌鍋(Hirayama)、電子天平(Sartorius)。

2 結(jié)果與討論

2.1 體視顯微鏡觀察

利用體視顯微鏡觀察樣品S1形貌，結(jié)果見圖2?？梢钥闯鰳悠稴1存在粘連、纖維斷裂、褪色等病害。樣品S1表層涂有黑色顏料，并書寫金色文字，書寫材料呈顆粒狀。黑色顏料下可見藍(lán)色纖維，部分染色層已剝蝕，露出黃色的底(圖2a)。進(jìn)一步放大觀察可確定黑色顏料層涂于藍(lán)紙之上(圖2b)。

圖2 樣品S1的體視顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 Stereomicroscopic images of Sample S1

2.2 SEM-EDX分析

利用掃描電子顯微鏡與能譜儀(SEM-EDX)分析樣品S1金色經(jīng)文書寫區(qū)域，結(jié)果見圖3和表1。鑒于金和碳元素均為主要分析對(duì)象，因此樣品既未噴金也未噴碳，將其平鋪于導(dǎo)電膠上。為了分析書寫區(qū)域與紙面的元素分布變化，特選取書寫區(qū)域與紙面的交界處。圖3中EDX1為金色經(jīng)文書寫區(qū)域，EDX2為無文字的紙面區(qū)域，該區(qū)域顏料層老化嚴(yán)重，表面雜質(zhì)顆粒較多，顏料缺失導(dǎo)致下層纖維隱約可見。

分析結(jié)果表明，整個(gè)區(qū)域(EDX1、EDX2)中C元素含量很高，推測(cè)所用顏料為墨。金色經(jīng)文書寫區(qū)域(EDX1)的Au、Ag和Cu元素明顯較紙面區(qū)域(EDX2)更多。分析金色顆粒(EDX3和EDX4)，發(fā)現(xiàn)其為金銀銅合金，且保存完好未受腐蝕，合金顆粒的主要成分為：Au含量72.8%～75.6%，Ag含量22.8%～26%，Cu含量1.2%～1.6%，推斷使用的金泥純度不高。金自古為貴重金屬，經(jīng)過細(xì)磨加工成為金泥，為貴重的金屬顏料[12]。書寫區(qū)域的Cl元素應(yīng)該來自于腐蝕產(chǎn)物氯化銀(AgCl)[13]。紙張中夾雜有少量的Ca、Si、Al、K等元素，應(yīng)是加入的填料，如高嶺土(Al2O3·2SiO2·2H2O)和CaCO3的混合物[10]。早在北魏時(shí)期，高嶺土就已用于紙張涂布，以提高紙張白度、平滑度和吸墨性[14]。古法造紙術(shù)中，造紙纖維類原料需經(jīng)過漚制、蒸煮、曝曬、清洗、切割和舂搗等工序，去除木素與果膠，以提高纖維間的結(jié)合力，而煮料通常為石灰水[Ca(OH)2]或草木灰(K2CO3)[14]。

圖3 樣品S1的SEM-EDX分析Fig.3 SEM-EDX analysis of the cross-section of Sample S1

表1 大藏經(jīng)樣品S1的掃描電鏡與能譜分析結(jié)果Table 1 SEM-EDX results of Sample S1 (%)

為了判斷S1樣品各元素的分布情況，對(duì)其元素分布進(jìn)行面掃描分析(圖4)。結(jié)果顯示，相對(duì)于紙面區(qū)域，金字書寫區(qū)中的Au、Ag和Cu元素均有明顯的富集，紙面區(qū)域中Al、Si、K、Ca元素有不顯著的增多趨勢(shì)。樣品元素面掃描結(jié)果均與SEM-EDX數(shù)據(jù)相吻合。

圖4 樣品S1的元素分布面掃描圖Fig.4 Element mapping of Sample S1

2.3 液相色譜-質(zhì)譜分析S1藍(lán)色染料

由于在SEM-EDX分析中未發(fā)現(xiàn)藍(lán)紙的顯色元素，因此推測(cè)使用了有機(jī)染料。利用高效液相色譜系統(tǒng)分析樣品S1的藍(lán)色染料纖維，結(jié)果見圖5。

分析結(jié)果顯示，在600 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下出現(xiàn)兩個(gè)藍(lán)色化合物，分別為保留時(shí)間在14.2 min和14.7min的靛藍(lán)和靛玉紅，表明樣品S1曾用靛青染料染色。常見的靛青染料來源有菘藍(lán)、馬藍(lán)、蓼藍(lán)、豆藍(lán)與木藍(lán)等[15]。靛青在我國(guó)有很長(zhǎng)的使用歷史，其提取需在加熱情況下加入石灰堿[Ca(OH)2]。如溫度適中，則生成藍(lán)色的靛藍(lán)素；如果溫度過高，堿性過強(qiáng)，則生成偏紅色的靛玉紅。后者是靛藍(lán)的同分異構(gòu)體。因此，靛青實(shí)為靛藍(lán)和靛玉紅的混合物[16-18]。

2.4 拉曼光譜分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證SEM-EDX和高效液相色譜系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果，利用顯微激光拉曼光譜分析藍(lán)色染料和其他顏料，結(jié)果見圖6。分析結(jié)果表明S1的藍(lán)色紙張采用靛青(C6H10N2O2)染色，紙上涂料為炭黑(墨)。

圖5 樣品S1藍(lán)色纖維高效液相色譜-質(zhì)譜分析Fig.5 HPLC-MS analysis of Sample S1

圖6 樣品S1藍(lán)色染料與黑色顏料的拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra of the blue and black pigments of Sample S1

2.5 紙張酸堿度分析

為檢測(cè)樣品S1紙張的酸化程度，將其表面浸濕，用酸堿度儀多點(diǎn)檢測(cè)，測(cè)得其pH值均在7.0～7.5之間。表明樣品基本在中性范圍，未酸化。

2.6 微生物病害分析

此批紙質(zhì)大藏經(jīng)表面存在大量微生物損害痕跡，因此從大藏經(jīng)表面采集微生物樣品2份，編號(hào)B1(粘連殘片)和B2(綠色霉斑)，采用光學(xué)顯微鏡觀察、電子顯微鏡觀察、微生物分離純化培養(yǎng)和高通量測(cè)序等方法，盡可能全面地了解大藏經(jīng)表面微生物的信息，包括細(xì)菌和真菌的種群類型和比例等，為大藏經(jīng)揭展和防霉材料篩選提供評(píng)估數(shù)據(jù)。

2.6.1掃描電子顯微鏡觀察 利用SEM觀察樣品S1，結(jié)果見圖7?？梢钥闯黾垙埨w維間散布有大量孢子，這是微生物繁殖的結(jié)果，微生物及其分泌物和孢子會(huì)造成部分纖維粘連[19]。

圖7 樣品S1表面微生物的SEM觀察Fig.7 SEM images of microorganism of Sample S1

2.6.2光學(xué)顯微鏡觀察 利用光學(xué)顯微鏡觀察樣品B2，結(jié)果見圖8。鏡檢結(jié)果顯示樣品中主要的微生物形態(tài)呈菌絲狀，菌絲直徑為7～10 μm，為絲狀真菌。

B2：真菌菌絲 圖8 樣品B2表面微生物顯微形態(tài)觀察Fig.8 OM image of microorganism of Sample B2

2.6.3樣品B2主要真菌的純化培養(yǎng)及分子鑒定

1) 樣品B2主要真菌的分離純化根據(jù)鏡檢結(jié)果(圖8)，設(shè)計(jì)分離純化培養(yǎng)真菌的PDA培養(yǎng)基，將樣品B2的綠色菌斑采用無菌操作技術(shù)，挑取少許在PDA+Amp(100 μg/mL)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。真菌的分離純化使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L(自然pH值)。

將樣品B2在培養(yǎng)基上初步培養(yǎng)的菌落進(jìn)一步分離純化，30 ℃培養(yǎng)3 d。結(jié)果如圖9所示。從平板上的菌落形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)這種真菌菌落均為綠色絨毛狀，菌絲生長(zhǎng)較致密，邊緣較明顯，菌絲呈綠色，分為氣生菌絲和營(yíng)養(yǎng)菌絲，部分氣生菌絲會(huì)分化出孢子囊的無性繁殖體結(jié)構(gòu)。菌絲多分枝，菌絲直徑7～10 μm。

圖9 樣品B2菌落平板形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.9 Fungal colony and its OM image of Sample B2

2) 樣品B2主要真菌的分子鑒定。針對(duì)樣品B2中分離純化的單菌落，收集菌絲，提取總DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)的鑒定。選用擴(kuò)增真菌ITS間隔區(qū)的通用引物ITS1-ITS4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下所示：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

反應(yīng)體系：模板4 μL，10×Taq酶buffer 5 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，引物(5 μM)各2 μL，Taq酶(5 U/uL)0.5 μL，加滅菌ddH2O至50 μL。

條件：95 ℃，5 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×30循環(huán)；72 ℃，10 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank，采用NCBI Blast功能進(jìn)行同源比對(duì)，判斷待測(cè)微生物的種屬。將純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，經(jīng)鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

2.6.4樣品B1高通量測(cè)序分析 將樣品B1(粘連殘片)用于克隆文庫檢測(cè)。表2為樣品B1中真菌菌群的高通量測(cè)序結(jié)果。

分析結(jié)果表明樣品B1中毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)比例為44.92%，為主要病害真菌，其次是曲霉屬(Aspergillussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)和白僵菌屬(Beauveriasp.)等。

眾所周知，館藏文物因真菌的腐蝕而受損的現(xiàn)象十分普遍，而一些特殊質(zhì)地的文物如棉、麻、皮毛、紙、絲綢等更容易被真菌所侵蝕。真菌的休眠期孢子普遍存在于文物上，并可萌發(fā)和繁殖，真菌菌絲在文物上有很強(qiáng)的增殖能力，菌絲可以深入有機(jī)質(zhì)文物組織內(nèi)部，對(duì)文物造成機(jī)械損傷[20]。真菌所分泌出的各種酶也是造成文物破壞的重要因素。微生物酶由活細(xì)胞產(chǎn)生，是一種活性蛋白質(zhì)，對(duì)含有蛋白的絲綢文物具有降解作用。除此之外，真菌產(chǎn)生的羧酸(例如草酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸)、色素等也會(huì)對(duì)文物造成化學(xué)損傷或者影響文物的美觀性[21]。

表2 粘連大藏經(jīng)樣品B1中真菌的組成比例Table 2 Proportion of fungi in Sample B1 (%)

2.7 粘連經(jīng)頁揭展建議

此次修復(fù)運(yùn)用傳統(tǒng)古籍修復(fù)技法中的干揭和濕揭兩種方法，揭開了約80%的經(jīng)頁。干揭法適用于粘連程度較輕的經(jīng)頁。用竹啟子插入經(jīng)頁粘連的縫隙處，輕輕深入，使經(jīng)頁縫隙逐漸擴(kuò)大，直至完全揭開，見圖10a。濕揭法適用于粘連程度較重的經(jīng)頁。首先將粘連程度較重的經(jīng)頁放入純凈水中浸泡5～6 h，取出后用毛筆蘸水逐頁揭開，見圖10b。這批大藏經(jīng)中靛藍(lán)染色的紙張固色性都比較好，沒有遇水脫落現(xiàn)象。對(duì)于有金粉書寫經(jīng)文的紙張，考慮到其珍貴性，同時(shí)其數(shù)量也比較少，一般用宣紙上下托覆后在蒸鍋中蒸10 min左右，然后揭取或展平。

約有10%經(jīng)頁粘連嚴(yán)重，使用傳統(tǒng)方法未能奏效。根據(jù)檢測(cè)和拆解試驗(yàn)的結(jié)果，選用蛋白酶K溶液作為助揭劑。蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(TritirachiumalbumLimber)分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酶[22-23]，因其能降解角蛋白而被命名為蛋白酶K[24]。蛋白酶K已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。pH范圍為7.5～12時(shí)蛋白酶K顯示最佳活性[22]。蛋白酶K的有效反應(yīng)溫度為25～45 ℃，在50 ℃或更高的溫度蛋白酶K會(huì)迅速降解[25-27]。為此，此次修復(fù)將蛋白酶K的工作溫度設(shè)定在30 ℃，濃度為1 mg/mL。

經(jīng)上述方法揭取后，仍有約10%粘連異常嚴(yán)重的經(jīng)頁無法揭開。經(jīng)與相關(guān)專家討論取得共識(shí)，目前應(yīng)盡量保留文物信息，待今后有更好的保護(hù)修復(fù)技術(shù)時(shí)再做處理。

圖10 粘連經(jīng)文的揭展Fig.10 Seperation of stuck paper

3 結(jié) 論

1) 甘肅省武威市博物館藏金色經(jīng)文大藏經(jīng)樣品S1以靛青染色，并以墨涂覆紙張表面。

2) 樣品S1金色書寫材料為金銀銅合金顆粒，其中Au含量72.8%～75.6%，Ag含量22.8%～26%，Cu含量1.2%～1.6%，所用金泥純度不高。

3) 金色經(jīng)文大藏經(jīng)紙張的pH值在7.0～7.5之間，未酸化。

4) 金色經(jīng)文大藏經(jīng)樣品S1紙張纖維間散布有大量孢子，這是微生物繁殖的結(jié)果，微生物及其分泌物是紙張粘連的原因。

5) 對(duì)樣品B2進(jìn)行微生物純培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

6) 對(duì)樣品B1進(jìn)行免培養(yǎng)的分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果表明主要病害真菌為毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)， 比例為44.92%；其次是曲霉屬(Aspergillussp.)、毛霉屬(Mucorsp.)和白僵菌屬(Beauveriasp.)等。

致 謝：本工作得到北京停云館文化投資有限公司王治濤先生，中國(guó)絲綢博物館周旸研究員與劉劍副研究員、中國(guó)文化遺產(chǎn)研究院葛琴雅研究員的幫助，在此表示感謝！