孟竹，張君濤

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，天津 300193)

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是全世界成年人中最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的慢性進(jìn)行性破壞，嚴(yán)重影響軟骨及周圍組織的退行性關(guān)節(jié)疾病[1]，其發(fā)病基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生。OA的發(fā)生發(fā)展就是軟骨單位(由關(guān)節(jié)軟骨、鈣化軟骨、軟骨下皮質(zhì)骨和骨小梁形成一生物復(fù)合物)的組成、功能特性以及結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[2]。隨著人口老齡化加劇及肥胖人群逐漸增多，OA的發(fā)病率呈逐年升高趨勢[3]，同時(shí)也受生活環(huán)境、遺傳及職業(yè)等其他因素影響，OA有望成為第四大致殘?jiān)騕4]。然而，目前OA的臨床治療手段主要包括抗炎鎮(zhèn)痛藥物、軟骨保護(hù)劑、關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、關(guān)節(jié)置換和中醫(yī)理療等，目的都在于減輕疼痛，保存軟骨功能，延緩關(guān)節(jié)退變，改善畸形，維持關(guān)節(jié)的正?；顒?dòng)，不能從根本上解決問題，無法阻止疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，尋找OA新的治療策略一直是骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

隨著科技發(fā)展，以干細(xì)胞為主的再生醫(yī)學(xué)以及生物治療是近些年來的研究熱點(diǎn)之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類具有自我更新能力的多潛能祖細(xì)胞，具有來源廣、分化能力強(qiáng)[5]等特點(diǎn)。相較于其他干細(xì)胞，MSC獲取及儲(chǔ)存相對(duì)容易，在具有強(qiáng)大分化能力的基礎(chǔ)上，免疫排斥更小，經(jīng)過不斷實(shí)驗(yàn)，MSC已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的干細(xì)胞[6]。同時(shí)大量證據(jù)表明MSC治療OA可獲得較好的療效[7-9]。但由于MSC受供體影響大量獲取困難、存活率有限以及對(duì)微環(huán)境敏感等諸多原因[10-12]，使得在臨床應(yīng)用還存在一些挑戰(zhàn)。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)MSC不僅通過自身增殖分化修復(fù)受損組織，還能通過分泌——外泌體(exosome，Exo)來改變微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能，間接實(shí)現(xiàn)修復(fù)治療作用。這為MSC直接應(yīng)用于臨床提供了另一思路，同時(shí)也為OA的治療提供了新的治療策略。本文就不同間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)和作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 外泌體

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的直徑為40-150 nm、密度范圍為1.09-1.18 g/mL的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣物質(zhì)，其內(nèi)容物包括多種蛋白標(biāo)志物、DNA 片段及RNA。其功能往往表現(xiàn)為細(xì)胞間通訊介質(zhì)，可遠(yuǎn)距離膜性轉(zhuǎn)運(yùn)供體細(xì)胞內(nèi)的生物小分子至受體細(xì)胞發(fā)揮其調(diào)控作用[13]。1983年，Johnstone首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體并命名為“exosome”。當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物，在之后的十多年中并未受到重視，直至1996年G Raposo等發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞也會(huì)分泌抗原呈遞外泌體，所分泌的外泌體可以直接刺激效應(yīng)CD4+細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。2007年H Valadi等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間可以通過外泌體中RNA進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換。從此外泌體逐漸引起了研究者們的重視。

外泌體由于其獨(dú)特的生物學(xué)特征，在多種疾病的診斷及治療中都有著諸多應(yīng)用，其作用機(jī)制也被不斷明確，如腫瘤可通過外泌體傳輸特異性miRNA、LncRNA來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲等多個(gè)生物學(xué)過程[14]。2010年，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體被首次報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證明其可明顯減輕小鼠心肌缺血再灌注損[15]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(MSC-Exosomes，MSC-Exo)定義了50-200納米的小泡，這些小泡在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的多泡體與質(zhì)膜融合時(shí)分泌到細(xì)胞外空間[16]。相較于MSC，MSC-Exo具有與之相似的生物學(xué)功能，在此基礎(chǔ)上還具有體積小、免疫原性低，并且不會(huì)永久作為移植物而存在，并且更易于優(yōu)化體外擴(kuò)增[17]等優(yōu)勢?？傊?，MSC-Exo具有更高的安全性、有效性及經(jīng)濟(jì)性，臨床應(yīng)用前景更為廣闊。

MSC-Exo不僅表達(dá)Exo特異性表面標(biāo)志物CD9和CD81，還表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型CD29、CD44、CD73和CD90[18]等。此外除了攜帶多種蛋白質(zhì)，還能轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA、miRNA和siRNA等多種RNA[19]，參與到蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)或靶基因調(diào)節(jié)，以此來實(shí)現(xiàn)再生修復(fù)作用。這也就導(dǎo)致了不同組織來源的MSCs雖然相似相似，但卻具有不完全相同的功能和潛力[20]，使得不同來源的MSC-Exo也不完全相同。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-BMSC)于1976年，F(xiàn)reidenstein首次發(fā)現(xiàn)，是人類最早發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞。具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，來源方便，易于分離培養(yǎng)，不存在免疫排斥等特性，因此成為組織工程最常用的種子細(xì)胞。

Gasado等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌 體 (Bone marrow mesenchymal stem cells-derived Exosomes，BM-BMSC-Exo)可以抑制滑膜淋巴細(xì)胞增殖，降低腫瘤壞死因子-α表達(dá)水平，減輕滑膜炎的炎癥，由此看來BM-BMSC-Exo亦可作為OA“抗炎藥物”。但BM-BMSC-Exo不僅僅具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。Cosenza等[22]發(fā)現(xiàn)BM-BMSC-Exo主要是通過抑制軟骨細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶13(matrix metalloprotein 13，MMP13)、聚蛋白多糖酶 5(a disintegrin and metalloproteinase withthrombospondin motifs 5，ADAMTS5)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，Col Ⅱ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan-1,Agc1)的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞活化。并且在膠原酶誘導(dǎo)的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型上證實(shí)BM-BMSC-Exo可促進(jìn)軟骨修復(fù)、降低炎癥水平，延緩OA進(jìn)程。與上述實(shí)驗(yàn)相比，Liu等[23]通過實(shí)驗(yàn)不僅發(fā)現(xiàn)BM-MSC-Exo可以增加Col Ⅱ和Agc1，減少M(fèi)MP13和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)，還發(fā)現(xiàn)BM-MSC-Exo可以通過lncRNAKLF3-AS1/miR-206/GIT1軸參與間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖以及抑制軟骨細(xì)胞凋亡。Qi等[24]發(fā)現(xiàn)BM-BMSC-Exo可以抑制p38和ERK的磷酸化并促進(jìn)AKT的磷酸化，通過調(diào)控這幾個(gè)通路來抑制由IL-1β起的線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療OA的作用。

2.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC)最早是由Zuk等[25]人從抽脂術(shù)中脂肪組織懸液中分離培養(yǎng)出來的，是源于脂肪組織的成體干細(xì)胞，相較于其他MCS,ADSC可通過皮下抽吸等方法獲得，同時(shí)使用ADSC的倫理爭議也較少[26]。由于其極強(qiáng)的遷移能力和腫瘤趨向性，目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域的研究31。但由于其能耐受缺血、缺氧的軟骨微環(huán)境引起的細(xì)胞凋亡，在OA治療方面也能表現(xiàn)出較好的效果[27]。但也有研究表明ADSC可以產(chǎn)生抑制軟骨細(xì)胞增殖和刺激軟骨細(xì)胞凋亡的因子[28]。

Tofi?o-Vian等[29]研究發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(ADSC-Exo)通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激來介導(dǎo)OA成骨細(xì)胞的抗衰老作用。在體外IL-1β處理的炎癥模型中，ADSC-Exo通過抑制β-半乳糖苷酶活性，減少炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和NO的產(chǎn)生，同時(shí)能顯著下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化和氧化應(yīng)激，是細(xì)胞抗衰老機(jī)制的可能性之一。Ragni等[30]研究發(fā)現(xiàn)ADSC-Exo可抑制OA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。

2.3 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞

2001年De Bari首次從膝關(guān)節(jié)附近滑膜中分離出滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞 (synovium-derived mesenchymal stem cell，SMSC)，相較于其他MSC,SMSC具有更強(qiáng)體外增殖能力[31]，并且不受疾病、年齡等因素影響[32]，通常取自自體并且極易誘導(dǎo)分化，較少會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)使其在臨床研究中的地位逐日劇增，可作為軟骨損傷、骨損傷及韌帶損傷等組織工程中的種子細(xì)胞。

Zhu等[33]研究發(fā)現(xiàn)在膠原誘導(dǎo)的(collagenase-induced，CI)小鼠OA模型中，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(SMSC-Exo)可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，延緩OA進(jìn)展，但不能使損傷軟骨恢復(fù)正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。Tao等[34]經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明SMSC-Exo攜帶的Wnt5a和Wnt5b通過Wnt信號(hào)通路激活YAP，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，但同時(shí)會(huì)顯著減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分泌。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，利用轉(zhuǎn)染得到過表達(dá)miR-140-5p的SMSC-Exo可以彌補(bǔ)這一缺陷，其機(jī)制主要是通過RALA信號(hào)通路激活SRY-Box轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9，SOX9)，避免抑制ECM的合成。過表達(dá)miR-140-5p的SMSC-Exo可以在不破壞細(xì)胞外基質(zhì)分泌的情況下增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，在大鼠模型中也得到了驗(yàn)證。

2.4 胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞

胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是早期胚胎或原始性腺中分離獲得的全能干細(xì)胞，擁有無限的自我更新能力以及多胚層分化能力，可誘導(dǎo)分化成幾乎所有種類和功能的細(xì)胞。但由于ESC存在倫理爭論、免疫抑制以及潛在的成瘤性等原因，限制了它在臨床上的應(yīng)用。誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell,IPSC)由Shinya Yamanaka于2006年報(bào)道相關(guān)性研究，擁有與ESC相似的胚胎干細(xì)胞特性，并且不受倫理限制，使得其逐漸代替ESC成為研究熱點(diǎn)之一。由于其成瘤性，臨床常用ESC/IPSC向MSC轉(zhuǎn)化作為臨床干細(xì)胞治療的來源[35]。ESC/IPSCMSC細(xì)胞擁有與BM-BMSC類似的免疫調(diào)節(jié)功能以及多向分化能力，同時(shí)無成瘤性，使得其在再生醫(yī)學(xué)中潛力無限。

Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)hESC-MSC-Exo可以減輕軟骨破壞和基質(zhì)降解，延緩OA 進(jìn)展。分別用IL-1β處理的原代小鼠軟骨細(xì)胞作為體外OA模型以及DMM模型小鼠作為在體OA模型，從兩方面證明hESC-MSC-Exo可以使CollⅡ的合成增加，ADAMTS5合成抑制，以此來維持軟骨細(xì)胞表型，減輕軟骨損傷，延緩了OA進(jìn)展。Zhang等[37]通過軟骨缺損大鼠模型表明hESC-MSC-Exo在修復(fù)臨界大小(直徑1.5mm，深度1mm)的軟骨缺損是有效的。經(jīng)過12周，hESC-MSCExo組無論在形態(tài)學(xué)或是組織學(xué)上均優(yōu)于對(duì)照組。主要通過激活A(yù)KT和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移并且增加M2型抗炎性巨噬細(xì)胞的浸潤。Zhu[33]等在膠原誘導(dǎo)的小鼠OA模型中，比較IPSC-MSC和SMSC分泌的Exo用于OA的治療效果。實(shí)驗(yàn)表明IPSC-MSC-Exo和SMSC-Exo均能緩解OA的進(jìn)展，但在體外IPSC-MSC-Exo具有更強(qiáng)的促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移能力的作用；小鼠OA模型中，IPSC-MSCExo組對(duì)軟骨的修復(fù)作用也優(yōu)于SMSC-Exo組。所以相較于SMSC-Exo，IPSC-MSC-Exo可能具有更好的治療效果。

2.5 圍產(chǎn)期組織間充質(zhì)干細(xì)胞

以上MSC在臨床研究應(yīng)用較為常見，此外，圍產(chǎn)期組織來源的MSC也受到越來越多的關(guān)注，如人胎盤、臍帶、羊膜來源的MSC。

2.5.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

Yan等[38]研究表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC)來源的外泌體(UMSC-Exo)通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和Smad2/3信號(hào)通路的激活，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、遷移和基質(zhì)合成，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。

2.5.2 羊水干細(xì)胞

Zavatti等[39]研究發(fā)現(xiàn)羊水干細(xì)胞(Amniotic fluid stem cell，AFCS)來源的外泌體(AFCS-Exo)在體外可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)變成M2型巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)抗炎因子IL-10和TGF-β1的表達(dá)，減弱促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的表達(dá)。在碘乙酸誘導(dǎo)的OA大鼠模型中，AFCS-Exo通過促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化修復(fù)軟骨損傷。

2.5.3 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(Placental tissue-derived MSC, PLA-MSC)成骨能力最好。蔣文捷等[40]提出PLA-MSC可能通過下調(diào)TNF-α、IL-1β及IL-6水平，抑制MMPs的分泌與鈣黏素11的表達(dá)，上調(diào)TGF-β水平，來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥與軟骨破壞。但是并未直接提出是PLA-MSC來源的Exo在起作用。

3 小結(jié)

綜上所述，不同來源的MSC-Exo治療OA已經(jīng)被人們逐漸發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證，除此之外，MSC-Exo含有大量的miRNAs，除了可以直接作用于靶基因或者靶蛋白外，還參與到多種信號(hào)通路傳導(dǎo)，如 SMAD、AKT、ERK等通路。更重要一點(diǎn)，部分miRNAs具有修飾作用，就如上述提到的過表達(dá)miR-140-5p的SMSC-Exo可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移并且不破壞細(xì)胞外基質(zhì)分泌；Sun等[41]也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-320c的BMMSC-Exo可更高效地促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制MMP13生成和增強(qiáng) Sox9表達(dá)。

雖然現(xiàn)在有大量證據(jù)能表明MSC-Exo對(duì)于OA有確切療效，但是許多功能及作用機(jī)制尚未完全闡明。此外，除了之前提到的IPSC-MSC-Exo比SMSC-Exo對(duì)OA的治療效果更佳以外，幾乎沒有其他實(shí)驗(yàn)研究不同來源的MSC-Exo哪種對(duì)于OA的療效最好。在今后的臨床研究中，除了進(jìn)一步探索MSC-Exo在體內(nèi)的確切機(jī)制，還應(yīng)注意到MSC-Exo最佳提取培養(yǎng)條件、臨床療程及劑量、如何修飾以達(dá)到最優(yōu)效果等等，以確保安全、有效，做到精準(zhǔn)醫(yī)療。

MSC-Exo在各個(gè)領(lǐng)域都在飛速發(fā)展，并且還有巨大的發(fā)展空間，在骨科疾病的治療中占據(jù)著重要的地位。雖然目前治療策略仍停留在體外研究階段，在臨床應(yīng)用方面還面臨著諸多問題，如生物安全性、道德倫理等。但相信在不久的將來，隨著研究進(jìn)一步深入，MSC-Exo會(huì)為OA治療提供一個(gè)更安全、更方便、更經(jīng)濟(jì)和更有效的治療方法。