陳志平，韓騰偉，林代華，周淑姮，劉維俊，劉 菁，肖方震，鄧艷琴

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的能造成機(jī)體全身性感染的人獸共患病。人感染后通常表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、乏力以及關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，臨床體征缺乏特異性[1]，轉(zhuǎn)化為慢性疾病后可反復(fù)發(fā)作、長(zhǎng)期不愈[2]；動(dòng)物感染后則常導(dǎo)致流產(chǎn)和不孕，嚴(yán)重影響人群健康與畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。近年來(lái)，我國(guó)布病發(fā)病率居高不下，發(fā)病數(shù)逐年遞增，全國(guó)范圍內(nèi)報(bào)告布病病例從2005年的18 個(gè)省份發(fā)展到2016年的31 個(gè)省份，其中大部分病例聚集于北方省份如內(nèi)蒙古、山西以及黑龍江等，南方地區(qū)主要為散發(fā)病例但也呈現(xiàn)遞增狀態(tài)[3]，形勢(shì)較為嚴(yán)峻。對(duì)布魯氏菌的分子流行病學(xué)研究有助于布病疫區(qū)性質(zhì)的鑒定，也有助于布病疫情的控制。本研究收集了福建省各設(shè)區(qū)市43 株布魯氏菌菌株，以MLST方法為手段探索其種群結(jié)構(gòu)及遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1布魯氏菌菌株 43株布魯氏菌菌株分離自2012-2018年福建省各設(shè)區(qū)市布病病例，由福建省疾病預(yù)防控制中心收集或分離、鑒定與保存。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器主要有電泳儀、電泳槽、CO2培養(yǎng)箱、冷凍高速離心機(jī)、梯度PCR儀、生物安全柜、凝膠成像儀等；試劑主要有布魯氏菌培養(yǎng)基(BD)、單相特異性血清A/M、硫堇/堿性復(fù)紅染料、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN)、DL2000 DNA Marker等，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定 根據(jù)菌落形態(tài)、染色、生長(zhǎng)特性和布魯氏菌診斷血清凝集試驗(yàn)對(duì)上述43株布魯氏菌進(jìn)行復(fù)核鑒定；利用單相特異性血清凝集試驗(yàn)(A/M)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、CO2需求、雙層瓊脂法噬菌體裂解試驗(yàn)、染料抑菌試驗(yàn)(硫堇/堿性復(fù)紅)等進(jìn)行種型鑒定，具體操作參照《布魯氏菌病防治手冊(cè)》[4]進(jìn)行。

1.4MLST引物 本研究選用布魯氏菌7 個(gè)管家基因(aroA、cobQ、dnaK、gap、glk、gyrB、trpE)、1 個(gè)基因間區(qū)(int-hyp)和1 個(gè)外膜蛋白基因(omp25)的序列進(jìn)行改良MLST分型研究，選取目標(biāo)基因片段較傳統(tǒng)MLST分型研究增長(zhǎng)約100～200 bp，部分引物參照文獻(xiàn)[5]合成，其余引物通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成，引物信息見表1。

表1 MLST靶標(biāo)基因、引物序列與擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5菌株DNA提取 將菌株轉(zhuǎn)種于布魯氏菌瓊脂斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取適量菌體于300 μL滅菌去離子水中，80 ℃ 2 h滅活，經(jīng)DNA提取試劑盒提取布魯氏菌DNA，按說(shuō)明書操作，-20 ℃保存。

1.6PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：2X PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 14 μL，引物(10 μmol/L)5 μL，模板1 μL。aroA、cobQ、dnaK、gap、gyrB、trpE、int-hyp7個(gè)基因PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。glk、omp25兩個(gè)基因PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性目標(biāo)條帶后送生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.7序列分析 整理測(cè)序結(jié)果，采用MLST在線分析工具(https://pubmlst.org/brucella/)對(duì)其進(jìn)行等位基因型與ST型的確定。通過Bionumerics 6.6軟件進(jìn)行聚類分析及繪制最小生成樹(MST)。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布 43株布魯氏菌分離株來(lái)源于福建省各設(shè)區(qū)市，分布情況為：福州4例，龍巖10例，南平6例，寧德2例，泉州3例，三明4例，廈門4例，漳州10例。其中，2012年4株，2013年8株，2014年5株，2015年8株，2016年6株，2017年5株，2018年7株。

2.2傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定與ST型鑒定 43株布魯氏菌分離株中，傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定顯示38株為羊種3型，5株為豬種3型；ST型鑒定顯示38株為ST8型，5株為ST17型。詳見表2。

表2 43株布魯氏菌菌株MLST分型與細(xì)菌學(xué)分型結(jié)果

2.3菌株聚類分析 通過Bionumeric 6.6軟件使用UPGMA方法，對(duì)福建省43 株布魯氏菌分離株的9 個(gè)位點(diǎn)、不同ST型、不同生物型以及菌株相關(guān)信息進(jìn)行樹狀圖聚類分析，繪制系統(tǒng)樹圖(圖1)。圖中顯示，5 株豬種3型菌株聚集成一簇，均為ST17型，來(lái)自于漳州地區(qū)；另38 株均為羊種3型菌株，均為ST8型，分布于福建省各設(shè)區(qū)市。選取國(guó)內(nèi)已發(fā)表文獻(xiàn)[5-6]中的192 株布魯氏菌分離株(羊種菌111 株，牛種菌52 株，豬種菌15 株，犬種菌14 株)MLST分型結(jié)果，與福建省分離株共同進(jìn)行聚類分析，通過Bionumeric 6.6軟件進(jìn)行MST圖的繪制(圖2)，根據(jù)分類系數(shù)確定不同菌株之間的最小進(jìn)化路徑[7]，結(jié)果顯示福建省與青海省、寧夏省、安徽省以及北京市共享ST8型，與吉林省、湖南省共享ST17型。ST7與ST8型之間遺傳距離較近，ST14與ST17型之間遺傳距離較近，ST7型與ST14型來(lái)源于青海省。

圖1 福建省43株布魯氏菌菌株MLST聚類分析系統(tǒng)樹圖

(圖中數(shù)字代表MLST基因型)

3 討 論

病原體常通過不同的分型方法進(jìn)行鑒定。在布魯氏菌分型研究中，如傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分型、脂肪酸分型與基因分型等方法均有應(yīng)用[8-9]。傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分型主要根據(jù)布魯氏菌的生化特性，并結(jié)合主要宿主的不同對(duì)其進(jìn)行鑒定，其產(chǎn)生的數(shù)據(jù)很難在實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比較而且通常不適合進(jìn)行進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育或種群遺傳學(xué)研究，而多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)可以有效的解決這一問題[10]。MLST主要是通過管家基因內(nèi)部片段的核苷酸序列來(lái)對(duì)分離的細(xì)菌和真菌進(jìn)行鑒定的一種方法[11]，其產(chǎn)生準(zhǔn)確的可傳輸?shù)男蛄袛?shù)據(jù)并且通過統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較[12]，具有簡(jiǎn)便、可比性強(qiáng)、可靠性高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，并且，omp25、virB5以及virB8等對(duì)毒力相關(guān)基因的多位點(diǎn)分析[13]，在了解病原微生物毒力系統(tǒng)發(fā)育方面也具有重要意義[14]。

目前研究中較常采用的MLST分型方法主要包括兩種：改良MLST分型研究(EMLST)與傳統(tǒng)MLST分型研究(CMLST)，EMLST相對(duì)于CMLST擴(kuò)增更長(zhǎng)的目標(biāo)基因片段，獲得的有效序列長(zhǎng)度顯著增加，陳燕芬等[5]曾對(duì)同一批菌株進(jìn)行ST型鑒定比較這兩種方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，EMLST相比于CMLST鑒定的各基因等位基因型與ST型型別更多，分辨率更高，因此本研究亦采用EMLST方法對(duì)布魯氏菌分離株進(jìn)行分型研究，以期鑒別發(fā)現(xiàn)更多不同的布魯氏菌ST型，探索福建省布魯氏菌分離株種群結(jié)構(gòu)與遺傳進(jìn)化關(guān)系。

本研究的43 株布魯氏菌分離株中，38 株為羊種布魯氏菌，5 株為豬種布魯氏菌，表明福建省布病優(yōu)勢(shì)菌種為羊種布魯氏菌，與全國(guó)范圍內(nèi)的分布趨勢(shì)相符[3]。38 株羊種布魯氏菌菌株分布于各設(shè)區(qū)市地區(qū)，提示不同城市之間可能存在著牲畜交易流動(dòng)；5 株豬種布魯氏菌菌株均來(lái)自于漳州，可能是與該地區(qū)近幾年從事豬類養(yǎng)殖、屠宰加工的高危職業(yè)人群迅速增加，以及周邊地區(qū)牲畜交易、流動(dòng)頻繁等因素有關(guān)[15]。

MLST分型發(fā)現(xiàn)，福建省布魯氏菌種群結(jié)構(gòu)由ST8與ST17型構(gòu)成，主要型別為ST8型，占菌株總數(shù)的88.4%，故福建省主要流行菌株為ST8型。MLST分型結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分型結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，相同生物型布魯氏菌可以分成不同的ST型，說(shuō)明MLST分型的分辨率高于細(xì)菌學(xué)分型，但兩者之間并無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)性，可能是因?yàn)閭鹘y(tǒng)分型方法主要受實(shí)驗(yàn)人員主觀判斷以及診斷試劑非標(biāo)準(zhǔn)化等因素影響，使得兩者之間的真實(shí)聯(lián)系被掩蓋[16]。

在布病疫情暴發(fā)關(guān)聯(lián)研究以及追溯傳染源方面，MLVA與MLST均為非常實(shí)用和重要的分子流行病學(xué)調(diào)查工具，且具有不涉及活菌、操作簡(jiǎn)便迅速、費(fèi)用較低、重復(fù)性較好等特點(diǎn)。韓騰偉等[15]曾對(duì)福建省布魯氏菌分離株進(jìn)行MLVA分型研究發(fā)現(xiàn)，40 株布魯氏菌可分為32 個(gè)型，相比于MLST分型分辨率更高，但MLST選取管家基因進(jìn)行分型，相比于MLVA更適合于進(jìn)化關(guān)系與種群結(jié)構(gòu)的研究[17]，二者均能夠?qū)⒔?jīng)典的生物種區(qū)分開來(lái)。

本研究整合國(guó)內(nèi)已報(bào)道的192 株布魯氏菌MLST分型結(jié)果同福建省分離株進(jìn)行聚類分析，MST圖顯示福建省布魯氏菌菌株與其他省份、地區(qū)菌株存在著高度同源性，如與青海、寧夏等省份共享ST8型，與吉林省、湖南省共享ST17型，另外，ST7型與ST8型聚集為一簇，兩者間存在3 個(gè)位點(diǎn)的變異，表明這2 種基因型關(guān)系較為接近；ST14型與ST17型聚集成一簇，兩者間存在著2 個(gè)位點(diǎn)的變異，關(guān)系最為接近。上述不同省份地區(qū)菌株與福建省菌株均出現(xiàn)了基因型相同或相似的情況，一方面表明了福建省與其他省份地區(qū)之間可能存在著牲畜及其相關(guān)制品流通；另一方面也提示我們需加強(qiáng)不同省份地區(qū)之間牲畜及其相關(guān)制品流通的檢疫監(jiān)管力度[15]。

多位點(diǎn)序列分型技術(shù)是適合于分子流行病學(xué)調(diào)查與遺傳進(jìn)化關(guān)系研究的一種方法手段，本研究收集福建省近7年的43 株布魯氏菌分離株進(jìn)行MLST分型研究，初步反映了福建省布魯氏菌菌株的種群結(jié)構(gòu)及遺傳多態(tài)性，但由于菌株量較少且包含的細(xì)菌種屬并不全面，使得福建省布魯氏菌屬細(xì)菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系并不夠明了，但在一定程度上也豐富了中國(guó)南方地區(qū)的布魯氏菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)。在今后的研究中，將繼續(xù)收集布魯氏菌分離株，以獲得更大量的樣本，使得分析結(jié)果更具有代表性。

利益沖突：無(wú)