劉加彬,張瑞梅,劉成永

耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，給中國(guó)乃至世界的結(jié)核病診療與控制工作帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織列出的30個(gè)高結(jié)核病負(fù)擔(dān)國(guó)家在全球的病例中，印度占27%，中國(guó)占9%，中國(guó)位列全球第二[1]。中國(guó)結(jié)核病報(bào)告發(fā)病人數(shù)始終位居法定乙類傳染病前列[2]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌異煙肼(INH)耐藥與katG、inhA、aphC，利福平(RFP)與rpoB等相關(guān)耐藥基因突變有關(guān)，并且不同的國(guó)家和地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的突變特點(diǎn)也不相同[3]。

我們的研究就是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和反向點(diǎn)雜交(RDB)相結(jié)合的基因芯片技術(shù),隨機(jī)抽取徐州地區(qū)耐多藥結(jié)核(MDR-TB)分枝桿菌，分析和發(fā)現(xiàn)本地區(qū)MDR-TB耐藥情況和相關(guān)基因突變特征，為耐多藥結(jié)核的快速診療和精準(zhǔn)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 研究涉及的MDR-TB菌株115株，敏感菌株66株來自徐州市傳染病醫(yī)院、徐州市疾控中心及徐州市10縣(市)、區(qū)結(jié)核病監(jiān)測(cè)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。菌株的傳代、培養(yǎng)和保存均由徐州市傳染病院完成。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37RV 由中國(guó)結(jié)核病控制中心臨床中心參比室提供。

1.2結(jié)核分枝桿菌改良羅氏比例法藥物敏感試驗(yàn)[4]改良羅氏比例法培養(yǎng)基內(nèi)含藥濃度按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)推薦的耐藥標(biāo)準(zhǔn)：INH(0.2 μg/mL)、RFP(40 μg/mL)、SM(4 μg/mL)、EMB(2 μg/mL)、KM(30 μg/mL)、OFX(2 μg/mL)。

1.3結(jié)核分枝桿菌鑒定 用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)法[4]

1.4藥敏培養(yǎng)基[4]抗癆藥物異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)、鏈 霉 素(SM)、卡那霉素(kanamycin，KM)均由徐州市傳染病院提供。

1.5結(jié)核分枝桿菌耐多藥基因芯片分析[5]結(jié)核桿菌(TB)全基因組有4 411 529 bp,約包括4 000個(gè)基因。研究發(fā)現(xiàn)TB耐藥性的發(fā)生與其基因突變相關(guān)。正常情況下，TB的KatG蛋白和InhA蛋白使異煙肼活化成異煙酸，使之具有殺菌的能力。當(dāng)katG、inhA基因發(fā)生突變時(shí)，過氧化氫-過氧化物酶、烯?；€原酶活性下降或喪失，阻止異煙肼變成活性形式，從而導(dǎo)致TB對(duì)異煙肼產(chǎn)生不同程度的耐藥。

利福平的耐藥性95%以上是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，突變均發(fā)生在rpoB509～533位的25個(gè)氨基酸(75 bp)組成的區(qū)域內(nèi)。rpoB基因是細(xì)菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因。當(dāng)其中81個(gè)堿基的核心區(qū)域-耐利福平?jīng)Q定區(qū)(RRDR)發(fā)生突變時(shí)，包括點(diǎn)突變或短的插入、缺失突變等，利福平不能與細(xì)菌RNA聚合酶β亞基結(jié)合，因而細(xì)菌表現(xiàn)為對(duì)利福平的耐受性。

本系統(tǒng)采用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和反向點(diǎn)雜交(RDB)相結(jié)合的基因芯片技術(shù)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因，引物一端標(biāo)記有生物素，擴(kuò)增好的產(chǎn)物都帶有生物素標(biāo)記。然后擴(kuò)增好的目的基因片段與膜芯片上的探針特異結(jié)合，再通過鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物與生物素結(jié)合，復(fù)合物在TMB作用和過氧化氫的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物有與探針結(jié)合的位置都會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色圓點(diǎn)。MTB耐藥突變基因檢測(cè)芯片來自深圳亞能生物。

1.6芯片法檢測(cè)位點(diǎn)[6]臨床疑似肺結(jié)核患者分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌核酸的定性檢測(cè)INH的katG、inhA和aphC基因各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)和RFP的rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)。

1.7樣本選擇 對(duì)徐州地區(qū)2015-2018年結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室耐多藥菌株采取單純隨機(jī)抽樣，結(jié)合徐州地區(qū)耐多藥率計(jì)算樣本數(shù)。數(shù)據(jù)錄入采取EXCEL軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1耐多藥情況 115例MDR-TB菌株耐藥情況有9種組合，主要是以耐INH+RFP組合為主，比例為47.83%，其次為耐INH+RFP+SM組合，比例為20.00%，其他組合均占一定比例，見表1。

表1 徐州市耐多藥菌株耐藥分析

2.2 基因突變情況

2.2.1INH相關(guān)基因katG、inhA及aphC變情況分析 115例MDR-TB菌株檢測(cè)出無基因突變14株，基因突變株101株，突變率87.83%。INH相關(guān)基因突變類型、例數(shù)和突變率分別為katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA雙基因14例(12.17%)、katG+aphC雙位點(diǎn)突變12.17%。見表2。在比例法研究敏感株66例中，有6例發(fā)生基因突變，突變率9.09%，主要突變基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，見表3。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數(shù)比較(t=107.56，P<0.05)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單個(gè)基因變異率均數(shù)比較katG(P<0.05)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 徐州市MDR-TB菌株INH相關(guān)基因突變分析

表3 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突變統(tǒng)計(jì)分析(INH)

2.2.2RFP相關(guān)基因rpoB突變分析 115例MDR-TB菌株檢測(cè)出無基因突變16株，基因突變株99株，突變率86.09%。耐RFP 的相關(guān)rpoB基因突變位點(diǎn)類型和例數(shù)分別為 單531位點(diǎn) 52例(45.22%)、單516 位點(diǎn) 10例(8.70%)、單526位點(diǎn) 2例(1.74%)，531+516雙位點(diǎn)突變16例(13.91%)、531+513雙位點(diǎn)突變14例(12.17%)、516+533雙突變位點(diǎn)1例(0.87%)。531+516+513三位點(diǎn)突變4例(3.48%),見表4。在比例法研究敏感株66例中，有8例發(fā)生基因突變，突變率12.12%，主要突變單513位點(diǎn)、單526位點(diǎn)，見表5。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數(shù)比較(t=94.92，P<0.05)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)二者比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。512二者均未檢出突變，見表5。

表4 徐州市MDR-TB菌株RFP相關(guān)基因突變分析

表5 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突變分析(RFP)

2.2.4MDR-TB菌株基因突變初復(fù)治分層分析 通過對(duì)115例MDR-TB菌株以患者初復(fù)治分層分析，二者無論是異煙肼，還是利福平，突變情況比較僅inhA(t=4.06，P<0.05)突變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表6。

表6 徐州市MDR-TB初復(fù)治患者菌株基因突變變化統(tǒng)計(jì)分析

3 討 論

耐多藥結(jié)核病的發(fā)生和流行，無論是對(duì)中國(guó)還是世界的結(jié)核病控制與診療帶來挑戰(zhàn)。在WHO比爾·蓋茨項(xiàng)目資金的支持下，為MDR-TB患者實(shí)施了免費(fèi)醫(yī)療，耐多藥結(jié)核發(fā)病率有所下降，但形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐多藥有9種組合，主要是以耐INH+RFP組合為主，比例為47.83%，其次為耐INH+RFP+SM組合，比例為20.00%，其他組合均占一定比例。這結(jié)果與其他地區(qū)有差異，主要原因與徐州地區(qū)的化療方案有關(guān)，席向宇等[10]研究也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。

本研究利用MTB耐多藥突變基因檢測(cè)芯片檢測(cè)了徐州市115株MDR-TB的INH相關(guān)katG、inhA及aphC因。115例MDR-TB的耐INH相關(guān)檢測(cè)出無基因突變株14株，基因突變株101株，突變率87.83%。INH相關(guān)基因突變類型及例數(shù)分別為katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA雙基因14例(12.17%)、katG+aphC雙位點(diǎn)突變12.17%。與66例敏感株發(fā)生6例突變，總突變率9.09%。主要突變基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這充分說明耐多藥基因突變的客觀性，檢測(cè)突變基因?qū)εR床用藥指導(dǎo)有明顯的指導(dǎo)意義。katG基因單位點(diǎn)突變率(64.35%)與浙江地區(qū)[11](69.3%)等報(bào)道相似；與中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核室陳燕等[3]研究(84.0%)、深圳地區(qū)[12](84.6%)、福建[13]等地報(bào)道區(qū)別較大，這說明katG315 突變存在一定的地區(qū)差異。katG+inhA基因(12.17%)、katG+aphC雙位點(diǎn)突變12.17%突變與陳燕等[3]研究也有比較大的區(qū)別。無論單個(gè)基因還是聯(lián)合多個(gè)基因變異均表現(xiàn)地區(qū)間差異，原因應(yīng)該進(jìn)一步分析。MDR-TB菌株和敏感株總體變異率均數(shù)比較(t=107.56，P<0.05)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。katG基因(P<0.05)二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明katG基因突變相對(duì)穩(wěn)定，有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值，可作為耐藥診斷的指標(biāo)。inhA、aphC因突變表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，僅對(duì)臨床有參考意義。

本研究利用MTB耐多藥突變基因檢測(cè)芯片檢測(cè)徐州市115株MDR-TB的RFP相關(guān)rpoB基因。115株MDR-TB菌株檢測(cè)出無基因突變16株，基因突變株99株，突變率86.09%。RFP相關(guān)rpoB基因突變位點(diǎn)類型和例數(shù)分別為單531位點(diǎn)52例(45.22%)、單516位點(diǎn) 10例(8.70%)、單526位點(diǎn) 2例(1.74%)、單533、513、512位點(diǎn)沒有檢出，531+516雙位點(diǎn)突變16例(13.91%)、531+513雙位點(diǎn)突變14例(12.17%)、516+533雙突變位點(diǎn)1例(0.87%)。531+516+513三位點(diǎn)突變4例(3.48%)。突變以531、516位點(diǎn)為主，531+516、531+513雙位點(diǎn)突變，531+516+513三位點(diǎn)突變均有檢出，徐州市RFP相關(guān)rpoB基因突變位點(diǎn)類型表現(xiàn)出多樣性。耐多藥株與敏感株突變位點(diǎn)也存在差異，敏感株發(fā)生突變的513、526位點(diǎn)，在耐藥株中很少檢測(cè)到。本研究單531位點(diǎn)(45.22%)與陳燕等[3]研究檢測(cè)結(jié)果(49.3%)相似，但其他單位點(diǎn)、多位點(diǎn)差異較大表現(xiàn)出地區(qū)差異。敏感株66例中，有8例發(fā)生基因突變，突變率12.12%，主要突變單513位點(diǎn)、單526位點(diǎn)，與陳燕等[3]研究敏感株的無任何突變的檢測(cè)結(jié)果有差異。MDR-TB菌株和敏感株總體及單個(gè)位點(diǎn)變異率均數(shù)比較t=94.92，P<0.05，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)，二者比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。512二者均未檢出突變，本研究表明rpoB基因531、516、533位點(diǎn)突變相對(duì)穩(wěn)定，有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值，可作為耐藥診斷的指標(biāo)。513、526、512位點(diǎn)突變表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，僅對(duì)臨床有參考意義，其應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，徐州市MTD-TB患者耐藥情況地區(qū)特征清晰，與耐INH或RFP相關(guān)基因突變客觀存在，并表現(xiàn)出多態(tài)性和地區(qū)性。與耐INH相關(guān)基因katG、與耐RFP相關(guān)基因rpoB531、516和533位點(diǎn)基因突變穩(wěn)定，可為MTD-TB診斷指標(biāo)體系建立提供科學(xué)依據(jù)，將為徐州市MTD-TB精準(zhǔn)而快速診療和控制提供幫助。

利益沖突：無