傅慶華 彭飛 范文娟 唐毅 劉征宇 鄭昭芬 顏素蘭 潘宏偉

(湖南省人民醫(yī)院 湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2檢驗(yàn)科)

缺血性心臟病(IHD)死亡率不斷上升〔1～3〕，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，到2020年將約有2 500萬(wàn)人死于IHD〔4〕。急性心肌梗死(AMI)是IHD中的急危重癥，院內(nèi)死亡率為6.7%～16.6%，再住院率5.28%～19.9%〔5～7〕，是冠心病的最大死因。AMI可導(dǎo)致心力衰竭、心源性休克、室壁瘤、栓塞等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，住院率高，并發(fā)癥嚴(yán)重〔8〕。近年來(lái)，肌鈣蛋白作為AMI的診斷指標(biāo)獲得了認(rèn)可和推薦，但在如何早期預(yù)防和識(shí)別AMI的高危人群上仍然缺乏有力的方法。

人類基因表達(dá)譜匯編數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)是一個(gè)開(kāi)放的基因表達(dá)譜芯片上傳數(shù)據(jù)庫(kù)。近年來(lái)，隨著基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)急速增長(zhǎng)，目前已積累了一些AMI病例和對(duì)照組的基因芯片數(shù)據(jù)，但這些研究通常集中在一種特定類型的AMI相關(guān)樣本中，并且缺乏臨床驗(yàn)證的證據(jù)〔9〕，本研究在AMI不同類型樣本中識(shí)別共同差異基因，更具普遍性意義，同時(shí)應(yīng)用定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性非常好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)，更加可靠，并探討這些基因表達(dá)差異的生物信息學(xué)意義，從而進(jìn)一步擴(kuò)充AMI分子致病機(jī)制基因方向的研究，為預(yù)防及診治AMI提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1芯片生物分析

1.1.1獲取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù) 搜索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，關(guān)鍵詞為 “Acute myocardial infarction”,“AMI”,and “Gene expression profile”。如果滿足以下兩個(gè)要求的研究將被納入：(1)既有AMI患者又有健康對(duì)照組；(2)有不同類型樣本的基因表達(dá)分析。

1.1.2原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理及差異基因篩選 芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用專業(yè)軟件(BRB-ArrayTools 4.3.2 Beta)進(jìn)行；芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理采用專業(yè)算法(JustRMA算法)完成；數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化及過(guò)濾采用中位數(shù)形式表示，兩組基因表達(dá)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)?；蜻^(guò)濾的相關(guān)條件：①基因中位數(shù)的改變不低于2倍，且改變數(shù)量級(jí)程度為總樣本數(shù)的20%以上；②相關(guān)基因表達(dá)的絕對(duì)缺失數(shù)據(jù)低于總樣本數(shù)的50%。利用專業(yè)數(shù)據(jù)工具(Class comparison)比較相應(yīng)樣本的數(shù)據(jù)集，找到AMI與正常樣本的差異表達(dá)基因。

1.1.3共同差異基因篩選 將兩張芯片篩出的差異基因作韋恩圖(Venn)分析，將兩張芯片差異基因中共同存在的少數(shù)基因定義為共同差異基因，并保存其在各芯片中的表達(dá)量用作后續(xù)分析。

1.1.4火山圖 經(jīng)t檢驗(yàn)篩選出表達(dá)差異顯著的基因，作火山圖，橫坐標(biāo)以t檢驗(yàn)顯著性檢驗(yàn)P值的負(fù)對(duì)數(shù)-log10(P-value)表示，縱坐標(biāo)以log2〔倍數(shù)變化值(Fold Change)〕表示，經(jīng)進(jìn)一步的優(yōu)化篩選，(如基因表達(dá)變化>2倍等)，篩選出顯著差異表達(dá)的基因用于后續(xù)研究。

1.1.5mRNA聚類分析 使用pheatmap R包對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析以P值大小為標(biāo)準(zhǔn)，將P值越小的前50個(gè)差異基因作聚類分析，以高亮的形式顯現(xiàn)出差異基因主要匯集區(qū)域。

1.2共同差異基因的臨床驗(yàn)證

1.2.1AMI患者及對(duì)照組 10例AMI患者(AMI組)和10例正常對(duì)照(對(duì)照組)被納入研究,所有患者符合2015年急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南〔10〕及2016非ST段抬高型急性冠脈綜合征診斷和治療指南〔11〕的AMI標(biāo)準(zhǔn)，AMI組年齡50～ 77〔平均(62.66±7.58)〕歲,男7例、女3例；正常對(duì)照由湖南省人民醫(yī)院體檢中心提供,年齡41～ 74〔平均(61.20±10.63)〕歲,男6例、女4例。

1.2.2血液RNA的提取 將受試者外周血標(biāo)本放入2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)試管中，進(jìn)行DNA分離。采用RNeasy微型試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)在血液取樣后24 h內(nèi)進(jìn)行RNA分離,并測(cè)量分離RNA樣品的RNA濃度和純度。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用RT2 HT第一鏈試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)對(duì)分離RNA進(jìn)行cDNA合成，測(cè)量分離cDNA的濃度和純度。同時(shí),用cDNA樣本對(duì)造血細(xì)胞激酶(HCK)、整聯(lián)蛋白αM(ITGAM)基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。使用RT2 qPCR引物分析工具包(Hilden,Germany)和mastermixes RT2 SYBR綠色qPCR Mastermix試劑盒(Hilden,Germany),用GAPDH作為內(nèi)參基因。人HCK基因上游引物:5′-CCA GGT CGG AGG CAA TAC-3′,下游引物:5′-GGG CAA CCA CGA TGA TGT-3′,產(chǎn)物167 bp;GAPDH基因上游引物:5′-CGG ATT TGG TCG TAT TGG G-3′,下游引物:5′-CGC TCC TGG AAG ATG GTG AT-3′,產(chǎn)物213 bp,由上海申友生物公司合成。實(shí)時(shí)PCR循環(huán)條件為:預(yù)變性95℃、5 min,變性94℃、30 s,退火50℃(GAPDH基因53℃)、30 s,延伸72℃、30 s,終末延伸72℃、7 min,數(shù)據(jù)收集40個(gè)周期。在每個(gè)延長(zhǎng)周期的末端收集熒光數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并描繪擴(kuò)增曲線和熔解曲線。調(diào)整基線并確定閾值周期。Ct值為熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)，ΔCt值是Ct值之間的差值。計(jì)算目標(biāo)基因和內(nèi)參基因間的ΔCt值。目的基因表達(dá)水平計(jì)算公式〔12〕：目的基因相對(duì)量=2-ΔΔCt。

1.3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)可應(yīng)用于2 031個(gè)物種，包含960萬(wàn)種蛋白和1 380萬(wàn)種蛋白質(zhì)之間的相互作用應(yīng)用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)分子經(jīng)過(guò)非共價(jià)鍵形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的過(guò)程。應(yīng)用STRING軟件對(duì)差異基因進(jìn)行PPI分析：登陸STRING官網(wǎng)(https://string-db.org/)，在多個(gè)蛋白質(zhì)(Multiple proteins)選項(xiàng)下提交差異基因列表，有機(jī)體(Organism)選項(xiàng)下選擇人類(Homo sapiens)，完成后點(diǎn)擊“SEARCH”。

1.4GO富集分析及KEGG通路分析 應(yīng)用DAVID及Cytoscape軟件的“Bingo”插件對(duì)整合后的差異基因進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析。第一步，登陸DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，選中基因ID轉(zhuǎn)換功能(Gene ID Conversion)，提交差異基因列表，并在標(biāo)識(shí)符選項(xiàng)(Select Identifier)中選擇官方基因符號(hào)(OFFICIAL_GENE_SYMBOL)，列表類型(List Type)選擇基因列表(Gene List)，最后點(diǎn)擊提交清單(Submit List)。

1.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.00進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1差異基因篩選

2.1.1收集基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集 收集序列號(hào)為GSE66360和GSE97320的兩張基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。GSE66360為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，其中AMI患者樣本49例，正常人樣本50例；GSE97320為血液，其中AMI患者樣本3例，正常人樣本3例。

2.1.2差異基因篩選及聚類分析

2.1.2.1GSE66360差異基因篩選 GSE66360共篩出差異基因349個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)56個(gè)，下調(diào)293個(gè)，如NR4A2、GABARAPL1、NFKBIZ、PDE4B，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分主要的差異基因如表1所示。

表1 GSE66360部分主要的差異基因

2.1.2.2GSE97320差異基因篩選 GSE97320共篩出差異基因2 425個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)1 027個(gè)，下調(diào)1 398個(gè)，如RNASET2、ITGAM、HUWE1、DAZAP2，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)old Change>2)，部分主要的差異基因如表2所示。

2.1.2.3共同差異基因篩選 從GSE66360與GSE97320中共有2 774個(gè)基因被提取并進(jìn)行分析，分別來(lái)自循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和血液，最后篩選出共同差異基因159個(gè)，其中上調(diào)基因75個(gè)，下調(diào)基因84個(gè)，共同差異基因如表3所示。其中包括C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族(CLEC)6個(gè)成員，核糖體蛋白(RP)5個(gè)，溶質(zhì)載體家族(SLC)4個(gè)成員,ZNP3個(gè)，這些同家族蛋白具有部分相同的結(jié)構(gòu)域。

表2 GSE97320部分主要的差異基因

表3 部分主要的共同差異基因

續(xù)表3 部分主要的共同差異基因

2.1.3火山圖 每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中按上述條件繪制的火山圖見(jiàn)圖1和圖2。以P值-log10為橫軸，以logFC為縱軸，可以很好地將兩張芯片中篩選的上調(diào)和下調(diào)共同差異基因分別顯示在0軸上下兩側(cè)。

2.1.4mRNA聚類分析 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)繪制的差異基因聚類圖見(jiàn)圖3和圖4。從圖中可以看出，差異基因可以很好地將正常組織和處理組織分開(kāi)。

圖1 GSE66360基因火山圖

圖2 GSE97320基因火山圖

圖3 GSE66360差異mRNA熱圖

2.2Real-time PCR驗(yàn)證

2.2.1兩組臨床資料比較 AMI組與對(duì)照組比較在舒張壓、空腹血糖(FBG)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而在年齡、體重指數(shù)(BMI)、收縮壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)方面差異統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.2.2兩組HCK、ITGAM基因表達(dá)情況比較 用平均ΔCt值比較AMI患者與對(duì)照組的HCK和ITGAM基因的相對(duì)表達(dá)量。低的ΔCt值表示基因表達(dá)量高。與對(duì)照組相比，AMI組的 HCK、ITGAM基因表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

2.3共同差異基因之間的PPI分析 PPI分析表明AMI的共同差異基因之間有復(fù)雜的相互關(guān)系，見(jiàn)圖5。例如IL1B與IRAK3、IL1R2、NFIL3、ITGAM,LRRK2與NFKBIZ、IRAK3、MAP3K8共同表達(dá)，同時(shí)NFKBIZ與MAP3K8也共同表達(dá)，而且LRRK2與這些基因的相互作用已被實(shí)驗(yàn)證明，ITGAM與多達(dá)16個(gè)基因有文本采掘證據(jù)或共同表達(dá)或數(shù)據(jù)庫(kù)證據(jù)等多種類型的證據(jù)，也有少數(shù)基因如MEST和SLC22A4間僅存在文本采掘證據(jù)，和其他基因無(wú)相互作用，而如RPH3A等基因與其他任何共同差異基因間無(wú)相互作用的證據(jù)。

2.4核心基因柱狀圖 通過(guò)核心基因柱狀圖(圖6)可以看到IL1B、JUN、JRRK2、ITGAM、HCK處于蛋白互作系統(tǒng)的核心位置，對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)起的作用最關(guān)鍵，其中最為重要的是IL1B、JUN、JRRK2，分別連接了25、23、22個(gè)節(jié)點(diǎn)，而ITGAM，既連接16個(gè)節(jié)點(diǎn)又是主要的共同差異基因之一。

2.5共同差異基因GO富集分析 在上述明確的159個(gè)AMI的共同基因里，最顯著的富集生物過(guò)程見(jiàn)圖7。最顯著的富集功能是“對(duì)生物刺激的反應(yīng)”(GO:0009607,P=0.000)及“防御反應(yīng)”(GO:0006952,P=0.000)。此外，它們也富集在“對(duì)其他有機(jī)體的反應(yīng)”和“對(duì)壓力的反應(yīng)”中。

圖4 GSE97320差異mRNA熱圖

表4 兩組臨床資料比較

2.6KEGG功能富集分析 使用DAVID對(duì)合成后的基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，我們共找到14個(gè)相關(guān)的KEGG通路，其中最主要的腫瘤壞死因子信號(hào)通路、利什曼病、百日咳、AMPK信號(hào)通路、礦物質(zhì)吸收、破骨細(xì)胞分化、趨化因子信號(hào)通路、幽門(mén)螺桿菌感染中上皮細(xì)胞信號(hào)及細(xì)胞因子與其受體相互作用(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表5 兩組HCK、ITGAM基因平均ΔCt值比較

圖5 共同差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖6 核心基因

圖7 共同差異基因GO富集分析結(jié)果

表6 共同差異基因KEGG通路富集結(jié)果

3 討 論

AMI大部分是冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致的，以往的研究表明動(dòng)脈粥樣硬化與高脂血癥、吸煙、糖尿病、高血壓、肥胖等危險(xiǎn)因素有關(guān)，其動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變與炎癥有關(guān)〔13〕。近年來(lái)基因芯片研究發(fā)現(xiàn)了與AMI有關(guān)的大量基因表達(dá)〔14～16〕，讓我們對(duì)AMI的遺傳發(fā)病機(jī)制有所認(rèn)識(shí)，但這些差異基因是在單一類型樣本中與正常對(duì)照組比較后發(fā)現(xiàn)的，未見(jiàn)對(duì)于不同類型樣本間共同差異基因的研究，而這些共同差異基因在AMI病理及病理生理過(guò)程中所發(fā)揮的作用可能更具有普遍性意義。通過(guò)對(duì)血液及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞兩個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)集的研究，篩選出了AMI的共同差異基因。

本研究共納入109個(gè)樣本，從2 784個(gè)差異基因中找到了159個(gè)共同差異基因，運(yùn)用大量的微陣列數(shù)據(jù)，將誤差率降得更低，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果變得更可信。

在篩選出的共同差異基因中，PPI分析結(jié)果提示，IL-1B、JUN、LRRK2、ITGAM、HCK是影響最大的5個(gè)因子。其中一些在以往研究〔17～21〕表明在AMI患者中上調(diào)，并有證據(jù)表明他們參與到形成AMI的某些途徑中。IL-1β是一種重要的炎癥性細(xì)胞因子，其在AMI中上調(diào)，癥狀出現(xiàn)后的24 h達(dá)高峰〔17,18〕，可持續(xù)3 w〔19〕。IL-1β與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，其mRNA在人類的高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化中表達(dá)增加〔20〕。整合素(ITGAM)是分布于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體，AMI患者的ITGAM上調(diào)可持續(xù)28 d甚至更久〔21〕。血小板膜上的ITGAMα2bβ3是GPⅡb/Ⅲa受體，其拮抗劑能發(fā)揮強(qiáng)有力地抗血小板作用。目前臨床上使用的ITGAMα2bβ3拮抗劑tirofiban及單克隆抗體阿西單抗(abciximab)廣泛應(yīng)用于AMI中。LRRK2與JUN未見(jiàn)于AMI的研究，而與帕金森病和阿爾茨海默病關(guān)系密切，Eugénie等〔22〕觀察到降脂藥物能推遲和減緩帕金森病的進(jìn)程,提示帕金森病與脂質(zhì)代謝有關(guān)系。而在本次的實(shí)驗(yàn)中，這兩個(gè)因子作為對(duì)AMI很重要的共同差異基因，應(yīng)當(dāng)對(duì)其進(jìn)行更多的探討及實(shí)驗(yàn)，期待后續(xù)有科研工作者對(duì)其展開(kāi)與AMI的系統(tǒng)性研究。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，“刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)” “response to external stimulus” “immune response” “regulation of response to stress”和“defense response”等生物進(jìn)程在AMI的發(fā)病過(guò)程中占重要地位。所有這些都可以引起炎癥反應(yīng)，而以往研究〔23〕顯示炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化和AMI過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與本結(jié)果高度相符。血管內(nèi)皮損傷啟動(dòng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)始，并持續(xù)作用于整個(gè)過(guò)程中，調(diào)脂藥物除了降低LDL、升高高密度脂蛋白外還通過(guò)抗炎作用治療冠心病。

在KEGG通路分析方面，共同差異基因主要影響 “腫瘤壞死因子信號(hào)通路”“利什曼病”“百日咳”和“AMPK信號(hào)通路”。腫瘤壞死因子是一種重要的炎癥因子，在AMI后升高，與GO分析結(jié)果相呼應(yīng)〔23〕。cAMP通過(guò)調(diào)節(jié)酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞許多代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。Andrew等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)在心?；蚍切墓?dǎo)致的心力衰竭動(dòng)物模型中百日咳毒素能顯著降低由于升高的cAMP水平帶來(lái)的正性肌力作用，但未提及百日咳和cAMP與AMI的直接聯(lián)系，需要進(jìn)一步研究明確，但因我們實(shí)驗(yàn)條件有限，還沒(méi)有達(dá)到可以深入研究其分子機(jī)制的條件，期待有條件的研究人員進(jìn)行后續(xù)研究。

通過(guò)實(shí)時(shí)PCR我們驗(yàn)證了AMI患者血液中共同差異基因中的HCK水平上調(diào)，與 Wen等〔25〕研究結(jié)果一致。Hck通過(guò)LPS/TLR4途徑誘導(dǎo)炎癥因子TNF和IL-6產(chǎn)生，參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程〔26〕?？梢?jiàn)本研究鑒定的共同差異基因符合臨床實(shí)際。但因?yàn)榻?jīng)濟(jì)及其他原因，無(wú)法將所有的共同差異基因做臨床驗(yàn)證，可在以后的研究中逐步完善。

AMI的生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)近些年不斷取得進(jìn)步。心肌肌鈣蛋白只在心肌細(xì)胞中特異表達(dá)，具有高敏感性、高特異性的特點(diǎn)，自從1987年第1次被描述檢測(cè)〔27〕，血漿心肌肌鈣蛋白I或T水平已經(jīng)成為診斷AMI的非常重要的工具〔28～31〕。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它在多種心血管疾病如心力衰竭、急性肺栓塞中的危險(xiǎn)分層和短期和長(zhǎng)期預(yù)后中也具有關(guān)鍵作用〔32〕。本研究鑒定的共同差異基因在敏感性與特異性上與肌鈣蛋白比較無(wú)優(yōu)勢(shì)，但仍可以就肌鈣蛋白聯(lián)合共同差異基因在AMI的危險(xiǎn)分層進(jìn)行研究。本研究識(shí)別出的差異基因中有的已經(jīng)以藥物形式參與AMI的治療，如ITGAM，所以進(jìn)一步研究這些差異基因具有廣闊的前景。

由于資料有限，本研究?jī)H集中于兩種標(biāo)本類型，得到的共同差異基因較多，指向性不是特別強(qiáng)。然而，在目前研究中發(fā)現(xiàn)的這些共同基因，可以作為進(jìn)一步探索和證實(shí)更多AMI樣本類型的候選差異基因庫(kù)。隨著日后基因表達(dá)數(shù)據(jù)的增多，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)更具有普遍性和代表性的差異基因。此外，芯片數(shù)據(jù)發(fā)布時(shí)間以及樣本個(gè)數(shù)也存在缺陷，因?yàn)闃颖緜€(gè)數(shù)問(wèn)題，不能完全統(tǒng)計(jì)各類人種及地區(qū)的不同，也可能不同的地區(qū)或人種之間所隱藏的共同差異基因有所不同。基于本研究的上述結(jié)果和討論，找到這些共同差異基因并進(jìn)行相關(guān)性分析后，有很多值得進(jìn)行的后續(xù)研究：①在AMI發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制。②在預(yù)測(cè)AMI發(fā)生中的臨床價(jià)值，是否能利用這些共同差異基因早期預(yù)測(cè)AMI及提前預(yù)防。③在AMI治療及預(yù)后方面的前景，尋找到AMI治療靶點(diǎn)或作為衡量治療療效的標(biāo)志。

綜上，AMI不同類型的樣本中存在共同調(diào)節(jié)基因，且其水平上調(diào)，這些基因間存在廣泛的相互作用。期待進(jìn)一步研究其在AMI中的可能機(jī)制及AMI早期預(yù)測(cè)、診斷、治療中的潛力，使患者獲益。