何廷美，陳善瑜，施小剛，柴宜均，樊佳琦，羅靜怡，程躍鴻，彭廣能*

（1.四川臥龍國家級自然保護區(qū)管理局 四川阿壩 623006；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 成都 611130）

芽囊原蟲（Blastocystis）是一種可寄生于人類和多種動物的厭氧性、單細胞腸道原蟲，在全球廣泛分布，主要經(jīng)過糞口以及接觸傳播[1]。先前的報道表明，該寄生蟲與腹瀉、腹痛和嘔吐等非特異性胃腸道癥狀相關，并疑似與腸易激綜合征（IBS）和蕁麻疹有關[2]。根據(jù)小亞基核糖體RNA（Small-subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因序列差異，芽囊原蟲目前可分為17 種亞型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亞型為人獸共患亞型，ST10～ST17 亞型僅感染動物[3]。芽囊原蟲已在人和多種動物中被報道，其中鹿科動物被報道的有梅花鹿、馬鹿、馴鹿[2,4,5]。2020 年4 月至5 月在對四川臥龍自然保護區(qū)野外野生動物腸道寄生蟲進行調(diào)查的過程中發(fā)現(xiàn)采集的水鹿（n=9）、毛冠鹿（n=4）糞便樣品檢出芽囊原蟲并鑒定出所感染的亞型分別為ST14（n=2）、ST5（n=1)、ST13（n=1）。據(jù)查未見有關于水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲的報道。該調(diào)查擴大了芽囊原蟲的宿主范圍且提示水鹿是傳播人獸共患芽囊原蟲的潛在宿主，具有一定的公共衛(wèi)生學意義。

1 基本情況

2020 年4 月-5 月對臥龍自然保護區(qū)野外野生動物腸道寄生蟲調(diào)查時采集到的9 份水鹿（Rusa unicolor）糞便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）糞便。隨后針對該糞便樣品基于SSU rRNA 序列的PCR 擴增方法檢測芽囊原蟲。

2 方法

2.1 糞便基因組DNA 的提取

每份糞便取200～300mg 置于2mL 離心管中，加入蒸餾水，混勻，12,000r/min 離心1min，棄上清，重復上述步驟直至清洗干凈表面的重鉻酸鉀得到清亮透明的液體。隨后按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit糞便全基因組提取試劑盒（OMEGA Biotek Inc D4015-01，USA）說明書的操作步驟提取DNA，操作完成后將DNA 放于 -20℃冰箱中待用。

2.2 PCR 擴增及測序

用 PCR 技術基于芽囊原蟲 SSU rRNA 基因位點對所提取的DNA 樣品進行擴增，將試劑和樣品 DNA 混勻后的 PCR 管置于PCR 儀中反應。根據(jù)文獻[6]中給出的引物和 NCBI 中的基因序列來設置引物和反應條件與反應體系。

1）引物：所需合成引物序列及產(chǎn)物DNA 片段大小見表1。

表1 芽囊原蟲PCR引物

2）反應體系：PCR 擴增體系為25μL，見表2。

表2 反應體系

PCR 擴增反應條件：94℃預變性5min；93℃變性1min；59℃退火1min；72℃延伸1min；循環(huán)30 次；72℃再延伸3min；10℃永久保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物技術有限公司進行單向測序。

2.3 SSU rRNA 序列分析

測序后的序列在NCBI 的Blast 上進行相似性比對，將所獲得的序列與GenBank 比對出來同源性最高序列進行比較，確定序列是否是芽囊原蟲的基因組，分析序列差異確定亞型。

3 結果

3.1 糞便中芽囊原蟲SSU rRNA 基因的PCR 擴增結果

9 份水鹿（Rusa unicolor）糞便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）糞便樣品中，擴增出4 份約為600bp 的陽性樣品，經(jīng)公司測序結果顯示，成功擴增出的4 份樣品均是芽囊原蟲陽性樣品，陽性樣品分別來源于3 份水鹿、1 份毛冠鹿，表明這些水鹿、毛冠鹿都感染了芽囊原蟲。

3.2 芽囊原蟲SSU rRNA 的序列分析及亞型分布

測序成功的序列在Blast 上進行相似性比對，結果顯示有4 個芽囊原蟲陽性樣品，被分別歸為3 類不同的序列，上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為 MT889739、MT889740、MT764942、MT889741。其中毛冠鹿源芽囊原蟲屬于ST13 亞型（MT889741）；另3 份水鹿芽囊原蟲樣品中，1 份屬于ST5 亞型（MT889740），2 份為ST14（MT889739、MT764942）。

4 討論

芽囊原蟲是人類和各種動物中最常見的寄生蟲之一[7]。一些研究發(fā)現(xiàn)，無論是在發(fā)展中國家還是發(fā)達國家，芽囊原蟲感染都與胃腸道和營養(yǎng)紊亂有關[7]。除人類外，該寄生蟲還經(jīng)常在動物宿主中發(fā)現(xiàn)，包括非人靈長類，以及其他哺乳動物，如偶蹄目、犬齒目、嚙齒類動物、有袋類動物以及鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、環(huán)節(jié)動物和昆蟲[8,9]。但在偶蹄目鹿科動物中目前已有梅花鹿、馬鹿和馴鹿感染芽囊原蟲的報道[2,4,5]，沒有水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲的相關報道。本文是關于芽囊原蟲感染水鹿、毛冠鹿的首次報道。

芽囊原蟲目前可分為17 種亞型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亞型屬于人獸共患亞型，ST10～ST17 亞型僅感染動物[3]。從偶蹄目中分離出的芽囊原蟲有11 個亞型，包括7 個已知亞型（ST1、ST3、ST4、ST5、ST10、ST13、ST14）和4 個新亞型（Novel1、Novel2、Novel3、Novel4）。其中ST5 亞型最為普遍[9]。本文中所鑒定的亞型有ST14（n=2）、ST13（n=1）、ST5（n=1），其中ST14、ST13 為動物特有的亞型僅感染動物。ST5 為人畜共患亞型，該亞型在江西省的農(nóng)村地區(qū)小孩和豬身上被發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)很多家庭飼養(yǎng)小豬，豬和孩子有時會共用室外區(qū)域[10]。這些報告表明ST5 具有人畜共患的潛力，水鹿可能是芽囊原蟲的潛在傳染源。

研究結果顯示，水鹿、毛冠鹿也是芽囊原蟲的宿主之一，且發(fā)現(xiàn)了水鹿源的人畜共患亞型，表明水鹿是芽囊原蟲人畜共患病的潛在傳染源。本文對水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲的首次報道使我們對芽囊原蟲宿主有了更加全面的認識。