LATE-PCR非標(biāo)探針法檢測食管癌易感基因ALDH2 rs671位點3種基因型

楊 斌，楊 瑞，周路敏，張振輝，馮 巍，趙貴森

食管癌(esophageal cancer,EC)是威脅人類健康和生命的主要惡性腫瘤之一[1]。早干預(yù)、早發(fā)現(xiàn)是EC防治的關(guān)鍵。我國人口基數(shù)大，只有集中資源于高危人群，進(jìn)行精準(zhǔn)干預(yù)、精準(zhǔn)篩查，才能保證防治的社會效果[2-5]。因此，準(zhǔn)確地識別高危人群，是高效防治的前提。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點rs671，是識別EC高危人群最有價值的遺傳標(biāo)記[6]。rs671在乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase2,ALDH2)基因的編碼區(qū)內(nèi)，有2個等位基因(G、A)，3種基因型(GG、GA、AA)。等位基因A主要見于東亞人群，與食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)密切相關(guān)[6-9]。GA型個體的酶活性顯著降低，ESCC風(fēng)險增加7倍多。SNP rs 671與其他ESCC風(fēng)險因素還有很強(qiáng)的交互作用。在飲酒人群中，GA型/GG型的比值比(odds ratio,OR)可高達(dá)13.5，群體歸因危險度(population attributable risk,PAR)超過50%[8-10]。SNP rs 671與多種其他腫瘤和心血管疾病也有密切的聯(lián)系[11-14]。

鑒于ALDH2 rs671的重要影響，對其分型方法的研究由來已久，可分為表型分型、基因分型兩大類[15]。前者如酒精斑貼試驗、面紅反應(yīng)問卷、呼氣試驗等，簡單易行，但影響因素多，易漏檢?；蚍中头?zhǔn)確、可靠，但成本高、操作復(fù)雜，大規(guī)模應(yīng)用受限[16-18]。本研究把LATE(Linear-After-The-Exponential)-PCR非標(biāo)探針技術(shù)和鏈融解曲線分析法(melting curve analysis,MCA)結(jié)合起來[19-26]，從模板提取、PCR擴(kuò)增、分型等方面對rs671位點的基因分型法進(jìn)行改進(jìn)，旨在簡化操作、降低成本，為EC高危人群篩查、法醫(yī)嫌疑人排查等大樣本分析提供合適的方法?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀(德國QIAGEN)，微量紫外可見分光光度計(杭州晶飛)，高速臺式離心機(jī)(上海安亭)；熱啟動Taq DNA聚合酶(加拿大Fermentas)，20×Eva Green熒光染料(美國Biotium)；本實驗室保存、SNP rs671基因型已知個體的口腔拭子[26]，GG、GA型各5人份，AA型2人份，用Chelex 100法提取基因組DNA，冷藏備用。

1.2 方法

從Genebank中獲取SNP rs671序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物和探針(表1)[22]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系25 μL，內(nèi)含引物和探針適當(dāng)濃度(表1),dNTP 0.25 mmol·L-1，MgCl212.5 mmol·L-1，10×Buffer 2.5 μL，熱啟動Taq DNA聚合酶1 U和模板DNA 2 μl，1×Eva Green熒光染料。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀上順次進(jìn)行擴(kuò)增和MCA/HRM分析。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 8 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 15 s，10個循環(huán)；86.5 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30～50個循環(huán)；98 ℃ 1 min，45 ℃ 5 min。MCA/HRM分析：從47 ℃開始，逐步升高溫度至92 ℃，每步上升0.1 ℃，Green/HRM通道采集熒光信號。Rotor-Gene 2.0.2.4軟件分析數(shù)據(jù)生成MCA/HRM圖譜，根據(jù)已知對照基因型數(shù)據(jù)自動判讀待測樣品基因型。

表1 引物與探針

2 結(jié)果

2.1 LATE-PCR靶片段單鏈制備

以設(shè)計的不對稱引物為基礎(chǔ)，經(jīng)優(yōu)化引物等體系成分的濃度、比例以及循環(huán)參數(shù)，可以得到典型的LATE-PCR擴(kuò)增曲線(圖1A)，實現(xiàn)了靶片段先雙鏈指數(shù)擴(kuò)增、后單鏈線性擴(kuò)增的設(shè)計目標(biāo)，最終得到較多可供雜交的單鏈片段。終產(chǎn)物直接進(jìn)行MCA分析，融鏈峰形態(tài)與目標(biāo)片段雙鏈的預(yù)期解鏈特征一致(圖1B)。根據(jù)預(yù)實驗情況，在十幾個循環(huán)后，降低變性溫度至86.5 ℃，可以抑制非特異性產(chǎn)物，同時有利于聚合酶活性的保持，合成更多的單鏈[27]。

A：在經(jīng)過短暫的指數(shù)增長期后，進(jìn)入單鏈合成期，熒光信號保持穩(wěn)定；B：產(chǎn)物中的雙鏈部分在85 ℃左右融解；S1、S2、S3分別以3種SNP型的樣品DNA為模板，每種重復(fù)2次；NC為空白對照不加模板；縱坐標(biāo)dF/dT為導(dǎo)數(shù)，即熒光強(qiáng)度隨溫度升高而下降的速率。

2.2 PCR產(chǎn)物直接MCA/HRM分型

鑒于本研究設(shè)計的擴(kuò)增片段只有71 bp，預(yù)期其中單個堿基變異即會對解鏈溫度造成可識別影響，并依此來進(jìn)行分型[28-30]。作者首先檢驗了LATE-PCR產(chǎn)物中的雙鏈部分直接MCA/HRM分型的可行性，結(jié)果見圖2?？梢姲衅斡袃蓚€融鏈區(qū)，GG型的兩個峰溫度均高于A型攜帶者，可以較為明顯的與非GG型區(qū)分開來。AG型與AA型之間的溫度差異較小，在模板DNA質(zhì)量均一性較差時可能會導(dǎo)致誤判。結(jié)合峰寬、峰位(溫度)、肩峰(HMA峰)等特征，或者采用高分辨率融解曲線 (high resolution melting,HRM)模式分析，可以提高AG型識別準(zhǔn)確率。

縱坐標(biāo)dF/dT為導(dǎo)數(shù)，即熒光強(qiáng)度隨溫度升高而下降的速率；AA、AG、GG為曲線代表的rs671位點SNP型。

2.3 非封閉探針分型

非封閉探針P-A和P-G，由25 bp基因序列和3’末端的3個額外添加組成，理論上不能被聚合酶有效延伸，可以在PCR前加入體系。但由于基因組序列和PCR過程的復(fù)雜性，這種3’末端不封閉的、較長的探針不適合在PCR前加入。在LATE-PCR后，用P-A探針可以區(qū)分A型攜帶者與GG型(圖3A)，用P-G探針，可以區(qū)分G型攜帶者與AA型(圖3B)。但應(yīng)該是受人為引入錯配的影響(表1)，P-G探針雜交融鏈信號偏弱。兩個探針合用，可以實現(xiàn)3種基因型準(zhǔn)確分型。在食管癌高危人群篩查時，僅用A型探針即可達(dá)到目的。但需要二次操作，打開擴(kuò)增后PCR管子，操作繁瑣且有污染的風(fēng)險[25]。

A：A型探針；B：G型探針；AA、AG、GG為曲線代表的rs671位點SNP型；縱坐標(biāo)dF/dT為導(dǎo)數(shù)，即熒光強(qiáng)度隨溫度升高而下降的速率。

2.4 封閉探針分型

鑒于上述非封閉探針的不便性，本研究設(shè)計了較短的、3’末端C6用氨基修飾封閉其延伸活性的探針，Pm-A、Pm-G。這種探針只有15 bp，退火溫度較低，與PCR退火溫度相差大，且不能被酶促延伸。因而可以在PCR前加入體系，實現(xiàn)全程的閉管操作，降低污染風(fēng)險。只用一條探針Pm-G，HRM模式下即可實現(xiàn)3種基因型的區(qū)分(圖4A、B)。兩個探針合用，可以相互印證分型結(jié)果(圖4C、D)。在HRM模式下，3種基因型區(qū)分度高，抗干擾能力強(qiáng)，盲測判型準(zhǔn)確率100%[28-30]。

A：A型探針，HRM校準(zhǔn)曲線；B：A型探針，HRM差異曲線；C：G型探針，HRM校準(zhǔn)曲線D：G型探針，HRM差異曲線；AA、AG、GG為曲線代表的rs671位點SNP型。

3 討論

全球每年新增和死亡的食管癌患者均高達(dá)50萬?；颊叩? a存活率僅有15%～25%，但早期EC的生存率可達(dá)80%以上[1]。通過內(nèi)鏡篩查，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以大幅提高EC生存率。但是如果僅依賴內(nèi)鏡，平均每篩查到1例早期EC的社會成本超過15萬元[2]。因此，必須先鎖定高危人群，然后再用內(nèi)鏡進(jìn)行精準(zhǔn)篩查[3-7]。

個體的食管癌易感性與環(huán)境和遺傳均有關(guān)系，以酗酒和ALDH2基因變異最有代表性。二者均為EC的危險因素，并且有很強(qiáng)的交互作用[6-8]。PAR分析表明，如果沒有rs671變異，飲酒者可減少約50%發(fā)病。另一方面，rs671等位基因A攜帶者，避免飲酒可大幅降低患EC風(fēng)險[7-10]。篩查ALDH2 rs671變異型，在當(dāng)前我國EC防治中降低發(fā)病率和死亡率兩個方面都有重要意義[9，15]。

方法的簡便性、經(jīng)濟(jì)性，在大規(guī)模人群篩查中，至關(guān)重要[15-16]。本研究立足DNA分型，在保證準(zhǔn)確可靠的前提下，從樣品、提取、PCR和分型等多個環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，以適應(yīng)大樣本排查要求。本研究以口腔拭子或唾液斑為檢驗對象，易于接受、便于推廣，樣品采集和保存方便。在DNA提取方面，借用法醫(yī)DNA的chelex法，單管即可完成模板制備[26]。用LATE-PCR非標(biāo)探針技術(shù)，把擴(kuò)增和分型集成起來，不需要酶切、電泳等繁瑣操作，不需要引物探針的熒光標(biāo)記，并且有多種分型策略可供選擇[19-22]。

在模板均勻良好的臨床研究中，或?qū)σ阎苽浜玫拇髽颖綝NA分型時，可采用直接MCA/HRM，不需要探針，甚至不需要后繼線性單鏈擴(kuò)增，即可實現(xiàn)A型攜帶者快速、經(jīng)濟(jì)篩查。在樣品、模板有一定挑戰(zhàn)性，又沒有高性能HRM設(shè)備時，可以采用非封閉探針法。雖然需要探針使用和相應(yīng)操作，但應(yīng)用本研究P-A型探針，可以保證分型相對經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確。在需要明確分清3種基因型，對準(zhǔn)確度、環(huán)境要求高時，可用3’末端C6氨基修飾封閉的探針，直接加入PCR體系，簡化操作，降低污染機(jī)會。

綜上所述，LATE-PCR結(jié)合非標(biāo)探針技術(shù)，可以實現(xiàn)SNP rs671的簡便、快速、閉管分型，預(yù)期在食管癌等疾病高危個體的篩查、酒精敏感個體篩查，藥效預(yù)判/個性化用藥，以及法醫(yī)嫌疑人排查等多個領(lǐng)域，有較好的應(yīng)用前景。當(dāng)然，本方法目前還僅限于單個SNP位點的探索，下一步如能同時分析乙醇脫氫酶2(alcohol dehydrogenase 2，ADH2) rs1229984、直接免提取擴(kuò)增、增加內(nèi)標(biāo)質(zhì)控等，將更具實用意義。