陳大衛(wèi)，任晨瑜，申菲菲，郭蕾，陳春萌，黃玉軍，張臣臣，關(guān)成冉，馬文龍，李啟明，楊鎖華，顧瑞霞

（1.揚州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225127；2.揚州市中醫(yī)院，江蘇 揚州225000；3.新希望乳業(yè)股份有限公司，成都610023；4.生合生物科技（揚州）有限公司，江蘇 揚州225100）

0 引言

腸道菌群在維持機(jī)體的健康過程中發(fā)揮著重要的作用，與人體的消化營養(yǎng)、免疫代謝、生物拮抗等密切相關(guān)。菌群中有益微生物與有害微生物的種類及數(shù)量長期處于動態(tài)平衡使得腸道微生態(tài)的良好環(huán)境得以維持[1-2]。而近年來，抗生素的過度使用使得腸道中有益微生物與有害微生物的種類、數(shù)量和比例發(fā)生異常變化[3-4]，導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡遭到破壞，宿主的正常代謝受到擾亂，胃腸道的發(fā)酵、消化食物的能力及定植抗力顯著下降[5]，降低了機(jī)體的免疫能力[6]，并誘發(fā)II型糖尿病、炎癥性腸病等許多胃腸道疾病[7-9]，對機(jī)體的健康產(chǎn)生了較大的影響。

乳酸菌作為腸道中的有益微生物，不僅可以通過代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸、氨基酸、糖類等活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)腸道菌群[10-14]，還可以通過爭奪腸道內(nèi)的營養(yǎng)素和占據(jù)有效的黏附位點來抑制腸道病原菌的生長，進(jìn)而改善腸道微生物菌群屏障，達(dá)到平衡腸道腸道微生態(tài)的作用[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，混合乳酸菌可提前激活機(jī)體對Reg IIIγ的免疫應(yīng)答，并通過顯著提高小鼠腸道內(nèi)IL-23、IL-22及My D88的表達(dá)量來提高機(jī)體的免疫能力[17]；同時相較于單菌株而言，混合乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物也更加豐富，發(fā)酵產(chǎn)品在風(fēng)味、功能特性等方面具有更多的優(yōu)勢[18-19]。因此，在許多發(fā)酵食品加工過程中，混合乳酸菌發(fā)酵受到廣泛關(guān)注與應(yīng)用。然而，目前對于混合乳酸菌的功能性研究較少，其作用機(jī)制也不清楚明確。因此，本文從廣西巴馬長壽人群糞便和云南新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出具有良好益生特性的乳酸菌，制備了混合菌懸液及其發(fā)酵乳，并對抗生素引起的腸道菌群失衡小鼠進(jìn)行干預(yù)，利用高通量測序技術(shù)來研究小鼠腸道菌群的變化，從而探索混合乳酸菌對抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

發(fā)酵乳桿菌Xn（Lactobacillus fermentumXn）、植物乳桿菌Yd（Lactobacillus plantarumLa、Yd）、鼠李糖乳桿菌J（Lactobacillus rhamnosusJ），分離自廣西巴馬長壽人群糞便樣品和云南新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品由揚州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室提供。

1.1.2 動物及飼料

SPF級BALB/c雄性小鼠6周齡，體重20±2 g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證：SCXK（蘇）2007-0001。

普通飼料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%），由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.1.3 主要試劑

鹽酸林可霉素注射液，四川天翔藥業(yè)；糞便基因組DNA提取試劑盒，德國Qiagen公司；DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；小鼠內(nèi)毒素（Endotoxin，ET）酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所；血清球蛋白測定試劑盒、免疫球蛋白G（Immunoglobin G，IgG）測定試劑盒，四川邁克生物科技有限公司；雙歧桿菌計數(shù)培養(yǎng)基（BBL）、腸球菌計數(shù)培養(yǎng)基（EC）及腸桿菌計數(shù)培養(yǎng)基（EMB），青島海博生物科技公司；TruSeq文庫構(gòu)建試劑盒、MiSeq測序試劑盒，美國Illumina公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

全自動滅菌鍋JF-SX-500，日本TOMY公司；超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Bugbox厭氧工作站，英國Ruskinn公司；7020型全自動生化分析儀，日本日立儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf股份公司；Multiskan Sky 1510全波長酶標(biāo)儀，美國ThermoFisher科技有限公司；Millipore Direct-8超純水儀，法國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳制備

菌懸液制備:將L.fermentumXn、L.plantarumLa、L.plantarumYd、L.rhamnosusJ于MRS液體培養(yǎng)基中活化2代后，6 000g離心10 min收集菌體，并用滅菌生理鹽水清洗菌體2次，按活菌數(shù)等比例混合懸浮于10%的滅菌脫脂乳中，使其活菌數(shù)為108CFU/mL，置于4℃貯藏備用。

發(fā)酵乳的制備：將活化好的4株乳酸菌按活菌數(shù)等比例混合后以3%的接種量接種至含6%蔗糖的、10%的滅菌脫脂乳中，42℃發(fā)酵至活菌數(shù)為108CFU/mL，置于4℃貯藏備用。

1.2.2 動物分組及模型建立

42只SPF級Balb/c雄性小鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)、透光和清潔衛(wèi)生，室溫為23.0±1.0℃，濕度為50%±5%的動物房中，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為12只空白對照組和30只模型組。用鹽酸林可霉素（300 mg/mL）連續(xù)灌胃3天造模，每天2次（0.2 mL/次）。造模成功后將模型組分為4組，兩組分別為混合乳酸菌菌懸液干預(yù)組和混合乳酸菌發(fā)酵乳干預(yù)組，每組6只；另外兩組為模型組和自然恢復(fù)組，分別為12只和6只，具體飼喂方式見表1?；旌先樗峋鷳乙焊深A(yù)組、混合乳酸菌發(fā)酵乳干預(yù)組按2.0 mL/100 g（108CFU/mL）分別灌胃菌懸液及發(fā)酵乳，對照組、模型組及自然恢復(fù)組灌胃等體積的0.9%生理鹽水，記錄每天的進(jìn)食量及每周的體重，以便調(diào)整灌胃量，并觀察動物的毛發(fā)變化、尾部肛口干凈程度等。

腸道菌群失衡的判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌及乳酸桿菌減少甚至消失，腸桿菌及腸球菌的數(shù)量不下降或下降比例小于雙歧桿菌及乳酸桿菌，腸道B/E值[20]（雙歧桿菌及腸桿菌菌落對數(shù)值之比）顯著下降，停藥7天后腸道菌群不能恢復(fù)正常為造模成功[21]。

表1 試驗動物分組及灌胃劑量

1.3 糞便腸道菌群的檢測

1.3.1 腸道微生物培養(yǎng)計數(shù)

分別取造模后模型組、停藥7 d后自然恢復(fù)組空白及對照組小鼠盲腸內(nèi)容物0.1 g至0.9 mL的無菌生理鹽水中，在振蕩器上使之勻漿，梯度稀釋后分別接種于BBL培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，利用平板計數(shù)法進(jìn)行活菌計數(shù)，其中BBL培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基置于厭氧工作站中培養(yǎng)。

1.3.2 糞便菌群的Illumina高通量測序

灌胃結(jié)束后，利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取各組小鼠糞便的基因組DNA，送至上海派森諾生物科技有限公司，利用Illumina測序系統(tǒng)對樣品基因組DNA的16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測序。

通用引物序列為F：5'-ACTCCT AC GGGAGGCAGCAG-3'，R：5'-TTACCGCGGCTGCTGGCA C-3'。PCR反應(yīng)條件：94℃熱變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，21個循環(huán)；72℃反應(yīng)5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶并進(jìn)行純化，BioTek酶標(biāo)儀對純化的產(chǎn)物進(jìn)行定量；構(gòu)建DNA文庫，均一化后進(jìn)行上機(jī)測序，具體方法參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[22-23]。

1.4 小鼠免疫指標(biāo)的測定

1.4.1 小鼠血清免疫指標(biāo)的測定

灌胃結(jié)束后，小鼠禁食一夜，分別從腹腔主動脈和下腔靜脈取血，移至非肝素化收集管中，0℃靜置30 min，3 000g、4℃離心15 min分離血清。利用日立7020全自動生化分析儀及試劑盒測定大鼠血清中內(nèi)毒素、球蛋白及IgG的含量。

1.4.2 小鼠脾指數(shù)的測定

灌胃結(jié)束后，小鼠稱量體重，頸椎脫臼處死之后摘取脾臟，將周圍組織剝離干凈后稱重。脾指數(shù)的計算公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

利用Qiime軟件、SPSS 20.0軟件及Origin16.0等軟件對試驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠腸道菌群失衡模型

小鼠灌胃鹽酸林可霉素3天后，背毛豎起、毛發(fā)無光澤、行動緩慢、并伴隨有少量腹瀉的癥狀，其腸道雙歧桿菌、乳桿菌等微生物的含量見圖1。

圖1 小鼠腸道菌群數(shù)量及B/E值

由圖1可知，鹽酸林可霉素造模后，模型組小鼠腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌及腸桿菌數(shù)量顯著低于空白對照組（P＜0.05），且B/E值也明顯下降（P＜0.05），而腸球菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；腸桿菌的下降比例為6.17%，均低于雙歧桿菌的12.63%及乳桿菌的25.06%；同時，在停藥7 d后自然恢復(fù)組小鼠腸道中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量未恢復(fù)或未接近空白對照組，表明小鼠的腸道菌群已失衡。

2.2 小鼠腸道菌群物種豐度及多樣性

稀釋曲線表明，每個樣品的取樣深度，也可以用來比較不同樣本中的物種多樣性情況，小鼠糞便樣品測序的稀釋曲線見圖2。Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種的多樣性。常用物種豐富度（Chao 1/ACE）、Shannon及Simpson表示，小鼠腸道菌群的Alpha多樣性見表2。

可見，隨著測得序列數(shù)量的增加，樣本的OTUs逐漸增大，但曲線趨于平緩，上升的趨勢變小，說明Illumina Miseq測序系統(tǒng)能夠獲得了糞便樣品中的絕大部分細(xì)菌序列，準(zhǔn)確地反映了腸道微生物的豐富度和多樣性。由圖2還可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測序數(shù)據(jù)量相同時，模型組小鼠的腸道菌群OTU數(shù)量低于空白對照組、混合乳酸菌菌懸液組及混合乳酸菌發(fā)酵乳組，表明鹽酸林可霉素的使用造成了小鼠腸道菌群的紊亂。

圖2 小鼠糞便樣品的稀疏曲線

由表2可知，鹽酸林可霉素降低了小鼠腸道菌群的alpha多樣性，其豐度指數(shù)與Shannon指數(shù)顯著低于空白對照組（P＜0.05），混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳的干預(yù)顯著提高了小鼠的ACE及Chao1豐富度及Shannon指數(shù)（P＜0.05），其豐富度指數(shù)也顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳能夠恢復(fù)由鹽酸林可霉素引起的腸道菌群紊亂。

表2 小鼠腸道菌群的Alpha多樣性

2.3 小鼠腸道菌群變化

抗生素的過度使用會對機(jī)體的腸道菌群產(chǎn)生較大的影響，而乳酸菌的干預(yù)具有良好的改善作用?；旌先樗峋捌浒l(fā)酵乳對腸道微生物的調(diào)節(jié)作用見圖3。

如圖3A所示，小鼠腸道菌群在門水平上主要為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）及放線菌門（Antinobacteria）。鹽酸林可霉素降低了腸道中厚壁菌門的豐度，同時增加了變形菌門和擬桿菌門的豐度，分別為36.58%和53.44%；混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳的干預(yù)增加了腸道厚壁菌門的豐度，同時降低了擬桿菌門和變形菌門的豐度，腸道菌群結(jié)構(gòu)與空白對照組較為相似。

由圖3B可知，空白對照組、干預(yù)組、模型組小鼠腸道在屬水平上的微生物主要為Bacteroidesspp.，Lachnospiraspp.，Ruminococcusspp.，未分類_S24-7屬，Pseudomonasspp.，Helicobacterspp.及Doreaspp.。鹽酸林可霉素降低了小鼠腸道菌群的多樣性，其在屬水平上的主要微生物種類少于其他組，主要為Parabacteroidesspp.，Clostridiumspp.，Escherichiaspp.及Blautia spp.；鹽酸林可霉素還增加了腸道中Escherichiaspp.和Clostridiumspp.的豐度，降低了Blautiaspp.的豐度；混合乳酸菌菌懸液及發(fā)酵乳較好的恢復(fù)了小鼠腸道中的微生物種類，同時還降低了小鼠腸道中Escherichiaspp.，Clostridiumspp.及Pseudomonasspp.等微生物的豐度，增加了Bacteroidesspp.，Lachnospiraspp.，Ruminococcusspp.和Blautiaspp.的豐度?？瞻讓φ战M小鼠腸道中Lactobacillusspp.的豐度為0.93%，而在模型組中則未檢測到Lactobacillusspp.，混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳干預(yù)后，小鼠腸道中的Lactobacillusspp.的豐度分別為0.26%、0.57%，說明混合乳酸菌菌液及其發(fā)酵乳均有助于小鼠腸道中Lactobacillusspp.的生長。

圖3 小鼠腸道微生物相對豐度變化

2.4 小鼠內(nèi)毒素、球蛋白和IgG的含量

抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失衡后，會導(dǎo)致機(jī)體免疫力的下降。混合乳酸菌及其發(fā)酵乳的干預(yù)對小鼠免疫能力的影響見圖4。

從圖4中可以看出，模型組小鼠血清內(nèi)毒素含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），脾指數(shù)、血清球蛋白及IgG含量均顯著低于對照組及干預(yù)組（P＜0.05），表明鹽酸林可霉素降低了小鼠的免疫能力?；旌先樗峋鷳乙杭捌浒l(fā)酵乳干預(yù)后，小鼠血清中內(nèi)毒素的含量顯著降低（P＜0.05），而脾指數(shù)、血清中球蛋白及IgG的含量顯著提升（P＜0.05）。混合乳酸菌發(fā)酵乳組小鼠血清中的球蛋白與IgG含量均高于混合乳酸菌菌懸液組，但不顯著（P＞0.05）。

3 討論

抗生素的治療或過度使用會增加腸道中有害微生物煩人數(shù)量，并降低有益微生物在腸道上的定殖能力，導(dǎo)致免疫活性物質(zhì)和免疫細(xì)胞的減少，造成了機(jī)體的免疫低下[23]。本研究中鹽酸林可霉素的使用，增加了小鼠腸道中Escherichiaspp.，Salmonellaspp.，Parabacteroidesspp.及Klebsiellaspp.的豐度，而這些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的腸毒素等有害物不僅增加了小鼠血清中的內(nèi)毒素含量，也破壞了腸道的菌群平衡[24-25]，使得腸道菌群的豐度和多樣性顯著下降（P＜0.05）；同時Salmonellaspp.會黏附并侵入腸上皮細(xì)胞，感染巨噬細(xì)胞，降低小鼠的免疫力[26]。

圖4 小鼠免疫指標(biāo)

表3 腸道菌群與免疫相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

試驗的混合乳酸菌的干預(yù)增加了小鼠腸道中Lactobacillusspp.，Blautiaspp.和Bacteroidesspp.的豐度，Lactobacillus spp.作為機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)中的重要成員，不僅可以通過其自身的磷壁酸或分泌的H2O2等活性物質(zhì)來誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖及IgA、IgG和TNF-α免疫活性物質(zhì)的分泌[27-28]，還可以通過改善腸道微生物代謝產(chǎn)生的氨基酸等與免疫相關(guān)的活性物質(zhì)來提高機(jī)體的免疫能力[11,29-30]；而Bacteroidesspp.作為機(jī)體腸道中的重要微生物，除了吸收和降解膳食中人體不能夠降解的多糖外，還參與膽酸和類固醇的代謝，調(diào)節(jié)細(xì)菌毒素的產(chǎn)生，并增強機(jī)體固有的免疫反應(yīng)等[31-32]。

通過對小鼠糞便菌群及免疫指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表3），小鼠糞便菌群中的Ruminococcusspp.的豐度與小鼠脾指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Lachno-spiraspp.及Blautiaspp.的豐度與血清中IgG含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Escherichiaspp.與血清中球蛋白及IgG含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Ruminococcusspp.，Lachnospiraspp.及Blautiaspp.均可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）[27,33]，而SCFAs則可以通過提高腸道上皮屏障功能及促進(jìn)機(jī)體分泌的免疫活性物質(zhì)和減少促炎細(xì)菌來改善機(jī)體的免疫能力[34-36]；有研究也發(fā)現(xiàn)，腸道中的Ruminococcusspp與其體內(nèi)的血脂水平成顯著正相關(guān)[37]，表明本研究中的混合乳酸菌干可能也具有一定的輔助降血脂功能。Blautiaspp.豐度的增加還有利于改善2型糖尿病及高血脂癥狀[38]；Escherichiaspp.屬于機(jī)會性致病菌，能通過定植在腸道黏膜上的特定位點與腸黏膜細(xì)胞相互作用發(fā)揮致病性，并通過代謝產(chǎn)生的毒素侵入免疫細(xì)胞來降低機(jī)體的免疫力[39]，而在本研究中，Escherichiaspp.還降低了小鼠血清中的球蛋白和IgG的含量。

4 結(jié)論

鹽酸林可霉素造成了小鼠腸道的菌群失衡，引起了小鼠免疫能力的下降。而混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳較好的恢復(fù)了小鼠腸道中的微生物種類及豐度，抑制了有害菌的繁殖，促進(jìn)了有益菌的生長，并通過改善腸道中與免疫相關(guān)的微生物來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力。