唐振華，李開(kāi)坤，謝芳，李孟偉，郭艷霞，彭麗娟，彭開(kāi)屏，楊承劍，梁辛

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所 農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001；2.玉林市畜牧站，廣西玉林537000）

0 引言

奶水牛在畜牧業(yè)發(fā)展中占領(lǐng)重要地位，在意大利、巴基斯坦和印度等國(guó)家，水牛奶是最主要的奶源。而在這些國(guó)家，乳腺炎成為限制水牛奶業(yè)發(fā)展的重要因素[1]。因此，乳腺炎病原體研究成為近年來(lái)研究重點(diǎn)。乳腺炎相關(guān)研究中，席曉敏等利用PCR-DGGE技術(shù)分析比較了乳腺炎和健康奶牛乳中微生物菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺炎患牛乳區(qū)細(xì)菌和纖毛蟲(chóng)菌群較健康牛復(fù)雜，微生物區(qū)系結(jié)果存在顯著差異（P＜0.05）[2]。曾雪琴等為對(duì)引起奶牛乳腺炎的病原進(jìn)行溯源，利用高通量測(cè)序法對(duì)乳腺炎和正常奶牛乳頭擦拭子和牛乳中的微生物多樣性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺炎牛乳微生物多樣性與健康牛乳相比存在巨大差異[3]。在國(guó)外，Lima等通過(guò)改進(jìn)牛奶DNA提取技術(shù)，利用高通量測(cè)序?qū)δ膛Ｈ橹械奈⑸锒鄻有?，特別是乳腺炎病原體（Klebsiellaspp.,Streptococcusspp.和Escherichia coli）進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺炎牛乳與健康牛乳相比存在大量的腸菌科（Enterobacteriaceae）和鏈球菌科（Streptococcacea）[4]。水牛牛乳微生物研究中，Catozzi等利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)137份奶樣進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)在屬水平上，微生物多樣性最高的是健康牛乳，其次是亞臨床乳腺炎牛乳，最低是臨床乳腺炎牛乳。以上研究可知，無(wú)論奶牛還是水牛，健康牛乳和乳腺炎牛乳中微生物多樣性存在巨大差異。但是，由于品種、地理位置、氣候、飼養(yǎng)環(huán)境等因素，乳腺炎致病原不盡相同，微生物多樣性也存在差異[5]。廣西地區(qū)屬亞熱帶氣候，夏季高溫悶熱，是水牛乳房炎高發(fā)季節(jié)，且由于地域和品種原因，主要病原菌未知，治療及藥物選擇存在盲目性，效果差，治療過(guò)程存在反復(fù)現(xiàn)象。且隱形乳房炎由于癥狀不明顯，未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，一直是奶牛養(yǎng)殖業(yè)難以解決的問(wèn)題。因此，為了獲得水牛乳房炎病原菌，本研究結(jié)合電阻率和體細(xì)胞獲得乳房炎奶樣，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和Alpha多樣性分析，從門（Phylum）、目（Order）、屬（Genus）和種（Species）水平研究對(duì)比廣西地區(qū)尼里-拉菲水牛正常牛乳和乳房炎牛乳中細(xì)菌多樣性，獲得乳房炎病原菌，驗(yàn)證通過(guò)電阻率診斷乳房炎可行性，為后續(xù)的水牛乳房炎治療奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

EDTA、蔗糖、Tris-HCl、SDS、苯酚氯仿異戊醇（25∶24∶1）等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；變?nèi)芫福╩utanolysin）、溶菌酶（lysozyme）、蛋白酶K、糖原（glycogen）等購(gòu)自Sigma公司；RNA酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集處理

在廣西壯族自治區(qū)水牛種畜場(chǎng)進(jìn)行奶樣采集，采集前用無(wú)菌棉蘸少量無(wú)菌水擦洗乳頭，擠掉頭乳，后將牛奶直接擠入無(wú)菌的離心管，乳腺炎組和正常組各采5頭牛，先用Draminski乳腺炎檢測(cè)儀（Draminski,Germany）測(cè)定電阻率，后每頭牛收集3管，每管50 mL。將所有樣品放入冰盒并立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體細(xì)胞測(cè)定和DNA提取。

1.2.2 體細(xì)胞測(cè)定

將采集的牛乳帶回實(shí)驗(yàn)室后，搖勻，用兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，用FOSSmatic fc體細(xì)胞測(cè)定儀進(jìn)行體細(xì)胞測(cè)定。

1.2.3 DNA提取

DNA提取參考Delbe’s等[6]和Rasolofo等[7]，并改進(jìn)。獲取的DNA濃度用NanoDrop測(cè)定。

1.2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及高通量測(cè)序

使用細(xì)菌通用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGC-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL，其中5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，F(xiàn)orward Primer（5μmol/L）0.8μL，Reverse Primer（5μmol/L）0.8μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2μL。補(bǔ)充無(wú)菌水至20μL。反應(yīng)條件為95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)。送美吉生物有限公司，用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 優(yōu)化序列統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)去雜

MiSeq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接（merge）成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。

再利用FLASH和Trimmomatic軟件過(guò)濾尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp窗口，如果窗戶內(nèi)的平均質(zhì)量低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads。

利用Usearch（vsesion 7.0），根據(jù)97%的相似水平進(jìn)行 類聚（cluster）成OTUs（Operational Taxonomic Units），且為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，各個(gè)分類水平包括目、屬等菌落組成。并通過(guò)Alpha多樣性分析研究乳中微生物多樣性，獲得微生物群落的豐富度和多樣性。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用EXCEL軟件處理，再用SPSS 17.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品電阻率和體細(xì)胞數(shù)

試驗(yàn)乳腺炎與健康奶水牛的區(qū)分主要通過(guò)牛乳電阻率和體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分組，參考Catozzi等[1]和Oikonomou等[8]，乳腺炎越嚴(yán)重，電阻率越低，體細(xì)胞數(shù)越大。由表1可知，乳腺炎組M1～M5電阻率指數(shù)維持在300以下，而正常組M6～M10電阻率范圍為420～730。而體細(xì)胞數(shù)乳腺炎組體細(xì)胞數(shù)范圍是80.41×104～121.21×104個(gè)，均超過(guò)5×105個(gè)。而健康奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)范圍是12.23×104～32.41×104個(gè)。

2.2 樣品的序列Alpha和β多樣性分析

Sobs、chao、ace指數(shù)反應(yīng)的是群落豐富度，shannon、simpson反應(yīng)的是群落的多樣性，而coverage反應(yīng)的是群落的覆蓋度。由表2可知，乳腺炎組shannon指數(shù)均顯著高于健康組，simpson指數(shù)顯著低于健康組（P＜0.05）。sobs、chao、ace指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。覆蓋度（coverage%）所有樣品均超過(guò)99%，沒(méi)有被測(cè)出的概率均很低。

表1 樣品電阻率和體細(xì)胞數(shù) （×104）個(gè)

表2 樣品中Alpha多樣性指數(shù)

稀釋度曲線反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。從圖1樣品稀釋度曲線以及對(duì)比表2的序列數(shù)可以看出，各個(gè)樣品都趨于平緩，說(shuō)明樣本測(cè)序數(shù)量是合理的。圖2 Venn圖可知乳腺炎組共有357個(gè)OTU，健康組共有346個(gè)OTU，其中共有的為315個(gè)OTU。

圖1 樣品稀釋度曲線

圖2 運(yùn)算分類單位（OTU）分布維恩圖

圖3 為乳腺炎和健康乳樣細(xì)菌PCoA分析，計(jì)算方法為weight_unifrac。由圖3可知，乳腺炎牛乳（R）細(xì)菌有部分OTU與健康牛乳（C）細(xì)菌重疊，部分OTU與健康組OTU分開(kāi)，且乳腺炎組（R）分布較分散，健康組（C）分布相對(duì)集中。

圖3 乳腺炎和健康牛乳中細(xì)菌組成PCoA分析

2.3 基于門水平的樣品多樣性分析

如表3為門水平（Phylum）乳腺炎組（R）和健康組（C）牛乳細(xì)菌多樣性比較和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，在門水平共檢測(cè)到6個(gè)，并進(jìn)行歸類分析。乳腺炎組、健康組水牛乳中占主導(dǎo)地位的均為變形菌門（proteobacteria），且健康組顯著高于乳腺炎組（P＜0.05）。兩組豐度差異顯著的還有厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria），乳腺炎組顯著高于健康組（P＜0.05）。

表3 乳腺炎對(duì)牛乳細(xì)菌門相的影響

2.4 基于目水平的多樣性分析

表4 為目水平（Order）乳腺炎組和健康組牛乳細(xì)菌多樣性比較和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果。從表4可知，健康組（C）、乳腺炎組（R）占主導(dǎo)地位目均為β變形菌目（Betaproteobacteriales）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）和假單胞菌目（Pseudomonadales），豐度比例均超過(guò)10%。兩組差異顯著的目共有4個(gè)，其中β變形菌目（Betaproteobacteriales）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）乳腺炎組顯著低于健康組（P＜0.05），黃桿菌目（Flavobacteriales）、芽孢桿菌目（Bacillales）顯著高于健康組（P＜0.05）。

2.5 基于屬水平的多樣性分析

表5 為屬水平（Genus）乳腺炎組（R）和健康組（C）牛乳細(xì)菌多樣性比較和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果，由表5可知，屬水平上，健康組（C）和乳腺炎（R）組占主導(dǎo)地位均為代爾夫特菌屬（Delftia）。差異顯著菌屬共4個(gè)，其中代爾夫特菌屬（Delftia）、單胞菌屬（Stenotrophomonas）乳腺炎組顯著低于健康組（P＜0.05），金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）顯著高于健康組（P＜0.05）。試驗(yàn)在乳腺炎組中檢測(cè)到鏈葡萄球菌屬（Staphylococcus）、球菌屬（Streptococcus），相對(duì)豐度分別為1.41±1.49%和1.07±0.79，而健康組未檢測(cè)到。

表4 乳腺炎對(duì)牛乳細(xì)菌目相的影響

2.6 基于種水平的多樣性分析

如表6為種水平（Species）乳腺炎組（R）和健康組（C）牛乳細(xì)菌多樣性比較和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果，在種水平上可對(duì)15類進(jìn)行歸類分析，其他豐度含量過(guò)低無(wú)法進(jìn)行歸類。由表6可知，乳腺炎組、健康組水牛乳中占主導(dǎo)地位均為代爾夫特菌（Delftia_tsuruhatensis）、單胞菌（unclassified_g_stenotrophomonas），健康組顯著高于乳腺炎組（P＜0.05）。而黃金桿菌（Chryseobacterium_anthropi）乳腺炎組顯著高于健康組（P＜0.05）。在乳腺炎組中還能檢測(cè)到鏈球菌（unclassified_g_Streptococcus）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus_sciuri）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus_xylosus），健康組未檢測(cè)到。

3 討論

3.1 乳腺炎對(duì)體細(xì)胞、離子濃度的影響

在奶牛飼養(yǎng)管理中，體細(xì)胞數(shù)（SCC）作為臨床乳腺炎發(fā)生的重要指標(biāo)，其升高與乳蛋白水平、脂肪酸改變、乳糖和礦物質(zhì)含量以及酶活性顯著相關(guān)。根據(jù)Catozzi等[1]和Oikonomou等[8]研究，亞臨床乳腺炎牛乳中體細(xì)胞（SCC）平均水平超過(guò)4×105個(gè)。Ogola等研究發(fā)現(xiàn)SCC水平超過(guò)6.19×105個(gè)顯著增加牛乳中酪蛋白、Na+、Cl-和游離脂肪酸水平[9]。Mungatana研究也發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起乳腺炎至亞臨床階段時(shí)，可造成乳SCC上升141%，同時(shí)游離脂肪酸、Na+、Cl-、和Cu2+分別上升49%、14%、16%和47%[10]。本試驗(yàn)則利用SCC水平和電阻率（離子濃度）作為評(píng)估乳腺炎嚴(yán)重程度的一項(xiàng)參考，以分析乳腺炎對(duì)乳中微生物多樣性影響。

表5 乳腺炎對(duì)牛乳細(xì)菌屬相的影響

3.2 乳腺炎對(duì)奶水牛牛乳微生物多樣性及豐度影響

乳房中正常的微生物菌群結(jié)構(gòu)能與宿主建立良好的關(guān)系，共同抵御病原微生物入侵[11]。然而由于地域、品種和環(huán)境因素影響，乳房中微生物菌群結(jié)構(gòu)不盡相同[12]?，F(xiàn)今對(duì)乳房微生物的研究特別是乳腺炎病原體的研究依然處于初級(jí)階段[5]。乳腺炎相關(guān)微生物研究中，曾雪琴等[3]利用高通量測(cè)序技術(shù)以及Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)乳腺炎牛乳中微生物豐度和多樣性與正常牛乳相比有巨大差異，不同個(gè)體差異很大，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。而Carlotta等[1]利用高通量技術(shù)研究卻發(fā)現(xiàn)健康奶水牛乳中微生物多樣性、豐度高于亞臨床乳腺炎奶牛，亞臨床乳腺炎奶牛乳微生物多樣性和豐度高于乳腺炎奶牛，與Oikonomou[8]研究結(jié)果一致。Svetlana[13]研究也發(fā)現(xiàn)健康奶牛初乳中微生物豐度和多樣性高于乳腺炎奶牛，這與常乳的趨勢(shì)是一致的。作者還發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)奶牛初乳微生物豐度高于多胎奶牛初乳，原因可能是生理結(jié)構(gòu)存在差異。本試驗(yàn)中，乳腺炎奶牛Shannon指數(shù)顯著高于健康組（P＜0.05）、Chao指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）,說(shuō)明乳腺炎牛乳中細(xì)菌多樣性顯著高于健康牛乳（P＜0.05），豐度差異不顯著（P＞0.05）,這與Oikonomou等結(jié)果相反。但乳腺炎組Shannon等指數(shù)組內(nèi)差異較大，其中M3的Shannon指數(shù)最高為2.771，M1的Shannon指數(shù)最低，僅為1.886。這與曾雪琴[3]等研究結(jié)果一致。原因可能個(gè)體、胎次、及乳腺炎嚴(yán)重程度存在差異。

表6 乳腺炎對(duì)牛乳細(xì)菌種相的影響

3.3 乳腺炎牛乳微生物結(jié)構(gòu)組成分析和病原體分析

乳房微生物對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康和乳產(chǎn)品安全起重要作用，因此成為近年來(lái)的研究重點(diǎn)。前人對(duì)健康奶牛乳中微生物研究中，Catozzi等[1]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)意大利地中海奶水牛健康組和乳房炎組門水平上占主導(dǎo)地位為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），屬水平上占主導(dǎo)地位健康組、乳房炎組分別為為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。而本研究發(fā)現(xiàn)尼里-拉菲水牛乳中門水平上占主導(dǎo)地位為變形菌門（proteobacteria）,屬水平上健康組和乳房炎組占主導(dǎo)地位均為代爾夫特菌屬（Delftia），與Catozzi等研究不同。但乳房炎均會(huì)造成主要門、屬顯著差異（P＜0.05），這與Catozzi等[2]結(jié)果一致。其他研究中Kuehn等[14]發(fā)現(xiàn)健康奶牛乳中主要菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas），其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和羅爾斯通菌屬（Ralstonia）顯著高于乳房炎牛乳(P＜0.05)。Oikonomou等[8]研究發(fā)現(xiàn)健康奶牛乳且體細(xì)胞超過(guò)2×104主要菌屬為丙酸菌屬（Propionibacterium）、好氧芽孢桿菌屬（Aeribacillus）、毛螺菌科（unclassified Lachnospiraceae）等，而一些健康、且體細(xì)胞數(shù)低于2×104奶牛乳中微生物主要為擬桿菌屬（Bacteroides）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等，說(shuō)明體細(xì)胞數(shù)與乳中微生物多樣性有一定關(guān)聯(lián)。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳房炎奶牛乳中主要存在金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）等，飼糧變化對(duì)乳中微生物有一定影響。由這些研究可知乳中微生物結(jié)構(gòu)變化有多方面原因，包括品種、地域、體細(xì)胞含量、飼糧結(jié)構(gòu)等，且乳房炎均會(huì)對(duì)牛乳中微生物結(jié)構(gòu)特別是占主導(dǎo)地位菌群造成改變。本試驗(yàn)從門、目、屬、種水平分析了奶水牛乳房炎細(xì)菌多樣性變化情況。結(jié)果表明乳房炎對(duì)水牛乳中主要門、目、屬、種豐度造成改變，健康組均顯著高于乳房炎組（P＜0.05），與Kuehn等、Oikonomou等研究結(jié)果一致。試驗(yàn)表3-表6還發(fā)現(xiàn)健康組主要菌群門、目、屬和種相標(biāo)準(zhǔn)差低于乳房炎組，各重復(fù)菌群結(jié)構(gòu)較為一致，而乳房炎組組內(nèi)差異卻很大。結(jié)合表1的電阻率以及體細(xì)胞數(shù)，不難發(fā)現(xiàn)M2、M3乳房炎相對(duì)嚴(yán)重，這可能是造成組內(nèi)差異的原因。圖3的PCoA分析也表明乳房炎組各重復(fù)分布分散，健康組相對(duì)集中。

乳房炎病原菌相關(guān)研究中，Supre等研究表明Mycolicibacteriumsmegmatis是造成奶牛乳房炎的主要病原體[16]，而Mycolicibacteriumsmegmatis歸屬于分歧桿菌屬（Mycobacterium）。Nedic等[17]研究表明，乳房炎可由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）造成，且會(huì)導(dǎo)致乳和血液中對(duì)氧磷酶1（Paraoxonase1）升高。Sun等研究認(rèn)為綠色氣球菌（Aerococcusviridans）也是造成奶牛乳房炎一種病原體，歸屬氣球菌屬（Aerococcus），作者通過(guò)收集北京地區(qū)1145份奶樣發(fā)現(xiàn)乳房炎牛乳中最高為葡萄球菌屬（Staphylococcus）占比為34.17%，其次為氣球菌屬（Aerococcus），占比為16.67%，鏈球菌屬（Streptococcus）僅為1.49%。且Sun等進(jìn)行了為期一年藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)氨基苷類抗生素、磺胺類和四環(huán)素類具有耐藥性[18]，且夏季是乳房炎高發(fā)期，發(fā)病率最高可達(dá)53%。Catozzi研究表明乳房炎病原體為鏈球菌屬（Streptococcus），乳房炎造成奶水牛乳中鏈球菌屬（Streptococcus）顯著升高，占比分別可達(dá)11.70%[1]，這與Oikonomou等[19]、Patel等[20]研究結(jié)果一致，但Catozzi等[1]發(fā)現(xiàn)健康組中葡萄球菌屬（Staphylococcus）顯著高于乳房炎組（P＜0.05），這與Oikonomou等[19]、Patel等[20]以及本試驗(yàn)結(jié)果不同，原因可能與地域和飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。Hommez等[21]和Watts[22]等研究則發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）與奶牛和羊臨床、亞臨床乳房炎有關(guān)，為主要病原體。許多研究還表明棒狀桿菌屬（Corynebacterium）是一種腐敗微生物，廣泛分布于牛奶、肉類等，影響產(chǎn)品品質(zhì)[23-24]。由以上研究可知，與乳房炎相關(guān)病原菌有分歧桿菌屬（Mycobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、分歧桿菌屬（Mycobacterium）和氣球菌屬（Aerococcus）等，但由于品種、地域以及飼養(yǎng)環(huán)境的原因，乳房炎主要病原菌不同。本試驗(yàn)中乳房炎病原菌中占比最高為金黃桿菌屬（Chryseobacterium），為6.48%，棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）均低于1.5%。這與Catozzi、Sun等和Supre等研究結(jié)果均不相同。乳房炎組金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）豐度顯著高于健康組（P＜0.05），這與Hommez等、Watts等研究結(jié)果一致。而鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）僅在乳房炎組檢測(cè)到。因此，本試驗(yàn)表明金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）與水牛乳房炎發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)，且金黃桿菌屬（Chryseobacterium）占主導(dǎo)地位。但要確定這些菌屬是否為水牛乳房炎病原菌，還需要大量取樣分析，并在不同季節(jié)、不同飼料配比進(jìn)行跟蹤，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為奶水牛乳房炎治療和對(duì)癥下藥提供參考，合理使用藥物。

4 結(jié)論

乳房炎會(huì)對(duì)奶水牛乳中細(xì)菌多樣性造成改變，顯著降低奶水牛乳中細(xì)菌主要門、目、屬種豐度。不同品種、地域乳房炎病原菌不同，本研究水牛乳房炎主要存在病原菌為金黃桿菌屬（Chryseobacterium），且乳房炎還造成水牛乳中棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）病原菌顯著豐度升高（P＜0.05），產(chǎn)生鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）。