甘薯耐冷組學(xué)及分子生物學(xué)研究進展

劉振雷 潘家荃 周樺楠 劉冠求 于濤

摘要：甘薯為喜溫短日照作物，起源于熱帶地區(qū)，對低溫較敏感。低溫冷害對甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)都會產(chǎn)生顯著影響，常造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，開展甘薯的耐冷分子生物學(xué)研究具有重要的理論和實踐價值?？偨Y(jié)了低溫對甘薯地上部分和地下部分的表觀危害癥狀及對甘薯生理生化方面造成的影響;列舉了近年來甘薯耐冷組學(xué)和耐冷microRNA方面取得的研究進展，研究結(jié)果為甘薯耐冷基因的挖掘及從分子層面揭示甘薯耐冷機理奠定了基礎(chǔ);介紹了目前基因工程在甘薯耐冷研究中的應(yīng)用，有效加快了耐冷分子化育種進程。同時，文章提出以加強甘薯抗冷性的QTL分子標記定位研究、推進甘薯冷信號分子傳導(dǎo)研究、深入開展利用基因工程技術(shù)3個方面為未來甘薯耐冷研究的重點方向，以期為甘薯耐冷研究及抗性育種提供理論參考和研究思路。

關(guān)鍵詞：甘薯;耐冷;組學(xué);分子生物學(xué);表觀危害癥狀;生理生化;研究進展

中圖分類號：S531.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0045-04

收稿日期：2021-10-10

基金項目：沈陽市專家工作站（編號：20220105）;沈陽市薯類產(chǎn)學(xué)研聯(lián)盟（編號：2022-CXY-076）;遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費計劃（編號：2021GR2927）。

作者簡介：劉振雷（1979—），男，遼寧沈陽人，碩士，副研究員，從事作物育種研究。E-mail：l15840049311@126.com。

通信作者：于 濤，碩士，副研究員，從事作物育種研究。E-mail：18802421111@139.com。

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]，別名番薯、紅薯和甜薯等，是旋花科甘薯屬中重要的塊根類作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1-2]。我國年生產(chǎn)甘薯水平處于世界首位，年種植面積約為237.37萬hm2，占世界甘薯種植面積的30.55%，年產(chǎn)量約為 5 192.2萬t，占世界甘薯總生產(chǎn)量的56.62%[3]。甘薯不僅是食品和飼料，而且是重要的工業(yè)原料和新能源作物，在食品和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中有著極其重要的作用[4]。甘薯屬于同源六倍體植物，基因組結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，通過常規(guī)雜交技術(shù)手段對甘薯進行遺傳改良既耗時又低效，其抗逆相關(guān)性狀的遺傳機理研究相對緩慢[5-6]。低溫脅迫是影響甘薯生長發(fā)育的主要非生物脅迫之一，也是限制甘薯地區(qū)推廣及甘薯產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)境因素[7]。因此，研究甘薯耐冷的分子生物學(xué)機制，對提高甘薯品質(zhì)及耐冷性具有重要意義。

1 低溫脅迫對甘薯的危害

甘薯起源于熱帶美洲，廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，而在寒冷地區(qū)種植較少[8-9]。Guy將低溫脅迫主要分為冷害（chilling injury）和凍害（freeze injury），冷害是指0 ℃以上低溫對植物形成的傷害，凍害是指低于 0 ℃ 低溫對植物形成的的傷害[7]。

1.1 甘薯地上部

成熟的甘薯植株形態(tài)結(jié)構(gòu)主要分為地上莖葉部和地下塊根部。在甘薯生長時期低溫脅迫會導(dǎo)致其葉片萎蔫、皺縮，從而影響光合作用地上部到地下部的營養(yǎng)運輸。低溫脅迫后觀察及測定葉片組織切片的結(jié)構(gòu)和電導(dǎo)率，結(jié)果表明細胞膜上過氧化強烈，電解質(zhì)外滲嚴重，甚至導(dǎo)致甘薯植株的死亡[10]。

1.2 甘薯塊根

低溫脅迫也會導(dǎo)致甘薯塊根變色和部分萎陷，從而對甘薯貯藏和萌發(fā)產(chǎn)生不利影響[11]。甘薯塊根收獲后含水量和呼吸速率高，但種皮較薄，因此甘薯貯藏對溫度要求嚴格[12]。不同的甘薯品種最佳貯藏溫度也不同，普遍來說，大多數(shù)甘薯的最佳貯藏溫度在12～15 ℃[13]。甘薯塊根遭遇冷害后主要癥狀包括由匍枝根霉（Rhizopus stolonifera Vuill.）引起的軟腐病和由塊根細胞壁破壞引起的普遍軟化，因此甘薯的采后貯藏是甘薯產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要瓶頸。綜上所述，低溫脅迫會對甘薯生長發(fā)育、貯藏和萌發(fā)產(chǎn)生不利影響，提高甘薯品種的耐冷性具有重要意義。

2 基于組學(xué)的甘薯耐冷研究

近年來，隨著生物信息學(xué)和測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的植物基因組測序完成[14]。甘薯是高度雜合的六倍體植物，組學(xué)相關(guān)研究進展相對緩慢，但近年來，新一代測序技術(shù)高效率低成本，促進了甘薯組學(xué)的發(fā)展[15-16]。目前，甘薯耐冷組學(xué)研究主要集中于轉(zhuǎn)錄組。

Ji等為進一步了解甘薯耐寒機制，將具有高貯藏能力的徐薯15-1和低貯藏能力的徐薯15-4在4 ℃下貯藏0、2、6周，進行轉(zhuǎn)錄組分析，共篩選出525個差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）并將其分為六個簇，結(jié)果分析表明在徐薯 15-1 中的表達高于在徐薯15-4中的基因數(shù)量，且隨著時間的推移顯著增加，為開發(fā)具有改良冷藏能力的新品種提供了候選基因[17]。除對塊根做低溫處理外，Ji等還對低溫脅迫和脅迫后恢復(fù)下對葉片進行了從頭轉(zhuǎn)錄組組裝，與對照組相比分別鑒定出2 461、1 017個DEGs，對數(shù)據(jù)進行GO和KEGG分析表明，與擬南芥耐寒COR基因的報道相反的是，甘薯中鑒定出的COR基因在低溫下沒有表現(xiàn)出增加的表達，揭示了甘薯對冷脅迫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)[18]。有研究表明，通過轉(zhuǎn)錄組測定甘薯在貯藏期間對低溫脅迫的反應(yīng)，數(shù)據(jù)表明低溫條件下18 681個基因表達上調(diào)，21 983個基因表達下調(diào)，許多DEGs與細胞膜系統(tǒng)、抗氧化酶、碳水化合物代謝和激素代謝有關(guān)，這些層面可能與甘薯的低溫抗性有關(guān)，為甘薯在低溫貯藏條件下的生化和生理結(jié)果提供了分子基礎(chǔ)[13]。趙曉飛對甘薯塊根進行低溫處理，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序產(chǎn)生了8.25 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，對照組與處理組相比共有 4 470 條DEGs，其中上調(diào)表達的Unigens有4 059條，下調(diào)表達的有411條，從中篩選出DREB/CBF家族轉(zhuǎn)錄因子SwDREB1B，實時熒光定量表明該基因受低溫誘導(dǎo)并上調(diào)表達，且與抗氧化酶的活性呈正相關(guān)[19]。

3 甘薯耐冷基因工程

甘薯遺傳背景復(fù)雜，雜交高度不親和，甘薯特殊的遺傳背景使得常規(guī)雜交育種面臨諸多挑戰(zhàn)，而通過生物技術(shù)基因工程等手段挖掘重要基因，可加速甘薯耐冷分子化育種進程[20]。Lee等克隆得到甘薯冷誘導(dǎo)過程中木質(zhì)素形成的過氧化物酶IbLfp基因，過表達IbLfp的轉(zhuǎn)基因甘薯塊根可能通過增強POD活性氧（ROS）的清除活性從而表現(xiàn)出更好的耐低溫性[21]。TmAF是黃粉蟲（Tenebrio molitor）中的一類抗凍蛋白，賴先軍等將TmAFP通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入甘薯體內(nèi)，對轉(zhuǎn)基因植株作低溫處理，處理表明轉(zhuǎn)基因植株相比于野生型植株有強大的耐低溫能力[22]。AtP3B基因在擬南芥中可作為蛋白質(zhì)伴侶及RNA伴侶提高植株的耐熱及耐冷性，Ji等在甘薯中過表達該基因，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的光合速率、更低的膜透性和更強的耐低溫性[23]。菠菜中編碼甜菜堿醛脫氫酶（BADH）的基因參與了植物體內(nèi)甘氨酸甜菜堿（GB）的生物合成，而GB含量的增加可提高植物對各種非生物脅迫的耐受性。Fan等將菠菜的SoBADH基因轉(zhuǎn)入甘薯中，BADH的異源過表達提高了轉(zhuǎn)基因甘薯植株對低溫等脅迫的抗性[24]。Kim等在甘薯體內(nèi)過表達了大豆冷誘導(dǎo)鋅指蛋白（SCOF-1），低溫處理轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn) SCOF-1 的表達與轉(zhuǎn)基因植株的低溫脅迫耐受性呈現(xiàn)正調(diào)節(jié)，SCOF-1的過表達可有效地調(diào)節(jié)甘薯的低溫脅迫[25]。Kim等在甘薯中過表達了擬南芥NDPK2基因，提高了轉(zhuǎn)基因甘薯抗氧化酶活性，增強了寒冷、高鹽和干旱脅迫的耐受性[26]。DREB1和CBF蛋白屬于AP2（ERE）轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥的耐寒性中起重要作用[27]，近年來，其在甘薯耐寒中的作用也被揭示。Li等從甘薯體內(nèi)分離得到SINA家族基因IbSINA5，并將其轉(zhuǎn)入甘薯，表明過表達IbSINA5通過CBF-SINA-COR途徑顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性[28]。Jin等通過基因工程技術(shù)獲得了過表達IbCBF3轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)基因甘薯植株，低溫處理下，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的耐冷性及抗氧化性[29]。

4 甘薯耐冷microRNA

microRNA是生物體內(nèi)由內(nèi)源基因編碼的、普遍存在的、非編碼的單鏈小分子RNA，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，甘薯microRNA相關(guān)研究逐漸增多[30]。Yu等對甘薯品種Covington幼苗進行4 ℃和47 ℃的溫度脅迫處理，對26 種 miRNA及其14個靶基因的不同時間段表達量分析顯示，低溫和高溫脅迫改變了甘薯幼苗中脅迫響應(yīng)相關(guān)miRNA的表達，可能通過調(diào)節(jié)次生代謝、防御反應(yīng)、ROS途徑和脫落酸（ABA）信號等過程來調(diào)節(jié)甘薯的生長發(fā)育﹐從而使甘薯對極端環(huán)境脅迫積極響應(yīng)[31]。Xie等為系統(tǒng)地研究甘薯在貯藏期間對低溫脅迫的反應(yīng)，通過通量深度測序技術(shù)對甘薯所有microRNA和降解產(chǎn)物進行測序，共鑒定出190個已知的miRNA和191個新的miRNA，qRT-PCR和測序數(shù)據(jù)共同證實了在低溫脅迫條件下和對照條件下差異表達的26個miRNA，miRNA和降解產(chǎn)物分析表明miRNA介導(dǎo)乙烯（SA）信號、ABA途徑和ROS途徑參與甘薯塊根在貯藏期間對低溫脅迫的反應(yīng)[32]。

5 展望

低溫脅迫會對植物細胞膜系統(tǒng)造成顯著影響，同時能抑制光合作用進而對植物的代謝平衡產(chǎn)生嚴重影響[33]。因此，甘薯耐寒研究對延長甘薯生育期，提升薯塊品質(zhì)，擴大甘薯在各地區(qū)的推廣具有重要意義。從基因組學(xué)和分子生物學(xué)角度不斷深入挖掘甘薯耐寒性遺傳機制的研究勢在必行。

5.1 加強甘薯抗冷性的QTL分子標記定位研究

QTL是指控制數(shù)量性狀的基因在染色體上的位置，而QTL定位就是通過檢測分子遺傳標記找到QTL之間的連鎖關(guān)系，并估算QTL的遺傳效應(yīng)值，最終將單個或多個QTL定位在具體的染色體上，進而輔助后代選擇[34]。植物的耐寒性為微效多基因控制的數(shù)量性狀，因此QTL的定位和克隆更加困難。盡快建立并完善甘薯耐寒性相關(guān)的直接形態(tài)鑒定指標，利用形態(tài)上的差異定位甘薯種質(zhì)資源中與耐寒相關(guān)的QTLs。著力改進作圖群體，構(gòu)建高密度甘薯分子遺傳連鎖圖譜，加強QTL的精準定位和克隆，深入理解甘薯耐寒機理，進而推進分子標記輔助選擇育種，加速甘薯耐寒種質(zhì)資源的選育。

5.2 推進甘薯冷信號分子傳導(dǎo)研究

植物受到低溫脅迫后，首先感受到低溫信號，之后發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，產(chǎn)生低溫抗性。目前，植物對冷信號的感應(yīng)子所知甚少，一些推測的低溫受體包括鈣離子滲透通道、組氨酸激酶、受體激酶、磷酸酯酶、光合機構(gòu)等[35]。但甘薯低溫脅迫信號響應(yīng)及耐寒信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機理還沒有深入研究。因此，今后可對甘薯低溫脅迫下冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的整個過程及多個途徑開展深入研究，進而從耐寒信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)層面上揭示甘薯耐寒的本質(zhì)。

5.3 深入開展利用基因工程技術(shù)加快甘薯耐冷分子育種的研究

基因工程技術(shù)能夠有效避免將野生種中的不利性狀引入栽培種，同時能夠加強對其他物種中抗性位點的利用，為提高甘薯耐冷性創(chuàng)造了有利條件。近年來，突變體庫的創(chuàng)建利用，轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)的廣泛應(yīng)用為植物耐冷相關(guān)基因的發(fā)掘和克隆提供了技術(shù)支撐。根據(jù)基因在逆境應(yīng)答中的作用，可分為調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游逆境應(yīng)答基因，如轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等及基因編碼的蛋白直接參與抗逆應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達，一直以來都是研究的熱點。CBF是冷馴化植物低溫應(yīng)答途徑中的關(guān)鍵基因。下游的冷調(diào)節(jié)基因同樣在植物耐冷研究中起重要作用，這類基因包含與抗氧化、脂類、碳水化合物、脯氨酸及多胺等代謝相關(guān)的酶、分子伴侶、胚胎發(fā)育、晚期富集蛋白、抗凍蛋白及其他一些滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因[36]。因此深入開展基因工程在甘薯耐冷分子育種中的應(yīng)用，采用多組學(xué)聯(lián)合法，不斷挖掘與甘薯耐寒相關(guān)的基因，進而通過遺傳轉(zhuǎn)化的方式，縮短獲得甘薯耐冷種質(zhì)資源的周期，加快甘薯耐冷分子育種的進程。

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