祖立闖，曹文學(xué)，吳春霞

（1.山東綠都生物科技有限公司 山東濱州 256600；2.鄒平市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 山東濱州 256200；3.濱州市沾化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心 山東濱州 256800）

鴨瘟又名鴨病毒性腸炎，是由鴨皰疹病毒I 型引起的一種急性、熱性、敗血性傳染病，鴨、鵝及多種雁形目禽類均易感，其臨床特征主要表現(xiàn)為腫頭流淚、兩腿麻痹、實質(zhì)器官退行性病變等[1,2]。鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種敗血性、接觸性傳染病，雛鴨、雛鵝、雛火雞等禽類均易感，其臨床特征主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和關(guān)節(jié)炎等[3,4]。鴨瘟和鴨疫里默氏桿菌病均是當(dāng)前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病，2020 年3 月，山東省高青縣某鴨場發(fā)生了疑似鴨瘟和鴨疫里默氏桿菌病混合感染病例，通過臨床和實驗室診斷對該病例進(jìn)行了確診，現(xiàn)將整個診斷過程報告如下。

1 發(fā)病情況

該鴨場共飼養(yǎng)肉鴨10,000 余羽，2020 年3 月中旬飼養(yǎng)的29日齡肉鴨率先發(fā)病，發(fā)病鴨精神委頓、食欲下降、流淚、咳嗽、腹瀉，一般發(fā)病后2～3d 死亡，發(fā)病初期死亡率較低，但發(fā)病4d 后死亡率迅速增加。經(jīng)詢問，該場進(jìn)行了新城疫、禽流感等疫苗的免疫接種，但未進(jìn)行鴨瘟、鴨疫里默氏桿菌疫苗的免疫接種。

2 臨床癥狀

發(fā)病鴨精神委頓，采食量下降甚至廢絕，體溫升高，羽毛松亂，翅膀下垂，兩腿麻痹無力，伏地不愿行走，呼吸困難，咳嗽，頭頸部明顯腫脹，眼瞼水腫，流淚，流鼻涕，具有下痢癥狀，排黃綠色或綠色稀糞，消瘦，衰竭至死亡。

3 病理變化

解剖病死鴨可見心包膜混濁、增厚，心外膜有纖維素性滲出物，肝臟腫大、出血、表面具有黃白色黏膜，脾臟腫大、壞死、呈暗褐色，腺胃黏膜和肌胃出血，整個腸黏膜充血、出血，氣囊內(nèi)具有干酪性滲出物，眼結(jié)膜出血，鼻孔和鼻竇內(nèi)具有大量分泌物。

4 實驗室病毒學(xué)PCR檢測

4.1 臨床病料樣品的處理與核酸提取

采集病死鴨的肝臟、脾臟、腸黏膜等組織病料，將其溶解于5倍體積滅菌生理鹽水中，經(jīng)研磨、凍融后，以12,000r/min 離心5min，吸取0.2mL上清液即為處理后的臨床病料樣品。利用病毒基因組DNA 提取試劑盒提取處理后的臨床病料樣品的核酸DNA。

4.2 引物合成

參照萬春和等[5]建立的鴨瘟病毒PCR 檢測方法，設(shè)計合成1對鴨瘟病毒特異性檢測引物（上游引物：5'-TAACGTCGTTTATACTGTTCCAC-3'；下游引物：5'-AGACCCAAATGACAGAACCT-3'），該特異性引物對鴨瘟病毒強毒株的預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1,019b p。

4.3 PCR擴(kuò)增

利用合成的鴨瘟檢測引物對臨床病料核酸DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Premix Ta q 25μL、上下游引物各1.0μL、核酸DNA 5μL、水18μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序為：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃45s，30 個循環(huán)；72℃10min。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖核酸電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在1,019b p 處具有一條特異性擴(kuò)增條帶（如圖1 所示），與預(yù)期大小一致，表明臨床病料樣品存在鴨瘟病毒核酸。

圖1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

5 實驗室細(xì)菌學(xué)檢驗

5.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集病死雞的腦組織，將其劃線接種含5%雞血清營養(yǎng)瓊脂平板，37℃厭氧培養(yǎng)24h 后，平板上生長出直徑大小為1～2mm 的單菌落，單菌落呈半透明、邊緣整齊和奶油狀，符合鴨疫里默氏桿菌的菌落特征。

5.2 形態(tài)特征觀察

挑取分離菌株單菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，結(jié)果如圖2 所示，顯微鏡下可見大量革蘭氏陰性小桿菌，單個或成雙存在，部分可見長絲狀，不形成芽孢，符合鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特征。

圖2 染色鏡檢觀察結(jié)果

5.3 生化鑒定試驗

將培養(yǎng)的分離菌株依次接種常規(guī)生化發(fā)酵管進(jìn)行生化鑒定試驗，結(jié)果如表1 所示，分離菌株對糖的分解活性較弱，具有明顯的糖發(fā)酵惰性，符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

5.4 藥敏試驗

采用K-B涂布法測定分離菌株對常見藥物的敏感性，結(jié)果表明分離菌株對氟苯尼考、阿莫西林、左氧氟沙星、強力霉素和頭孢噻肟等藥物敏感，對磷霉素和鏈霉素耐藥。

6 綜合診斷結(jié)果

綜合發(fā)病情況、臨床特征和病理變化等臨床診斷結(jié)果以及病毒學(xué)PCR 檢測、細(xì)菌學(xué)檢驗等實驗室診斷結(jié)果，綜合判定致病原為鴨瘟和鴨疫里默氏桿菌混合感染。

7 討論

近年來，隨著我國水禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，鴨群異地流通加劇，鴨病流行情況日益復(fù)雜，疫病混合感染情況時常發(fā)生，疫病的混合感染或并發(fā)感染不僅增加了疫病的危害程度和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，也使臨床診斷和治療難上加難。對于混合感染的病例，僅通過臨床特征很難進(jìn)行確診，需要借助實驗室檢測方法進(jìn)行鑒別診斷。在病毒學(xué)的實驗室檢測方法方面，PCR 方法具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點，且能夠檢測到致病原特異性的核苷酸序列，是目前基層獸醫(yī)實驗室進(jìn)行疫病確診的常用分子生物學(xué)檢測方法，故在本病例中，利用萬春和等[5]建立的鴨瘟病毒PCR檢測方法對臨床病料進(jìn)行了檢測，增加了診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。在細(xì)菌學(xué)的實驗室檢測方法方面，細(xì)菌的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和生化特性等基本特征能夠鑒別不同菌群，也是基層獸醫(yī)實驗室進(jìn)行細(xì)菌檢驗的常用檢測方法，故本病例通過培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察、生化鑒定試驗等對臨床病料進(jìn)行了檢測，確定致病原中存在鴨疫里默氏桿菌。由于抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的大量濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐步增加，本病例通過藥敏試驗證實該鴨場的鴨疫里默氏桿菌已經(jīng)對磷霉素、鏈霉素產(chǎn)生了耐藥性，應(yīng)加強重視。同時，本病例中通過藥敏試驗篩選到了氟苯尼考、阿莫西林、鹽酸多西環(huán)素以及頭孢噻呋等敏感性藥物，為及時準(zhǔn)確的選擇治療藥物提供了參考依據(jù)，也避免了抗生素的進(jìn)一步濫用?？傊?，本研究結(jié)合臨床診斷和實驗室檢測方法對此次疫病進(jìn)行了確診，準(zhǔn)確診斷致病原為鴨瘟和鴨疫里默氏桿菌混合感染，使養(yǎng)殖場能夠及時快速采取針對性治療措施，并有效降低了經(jīng)濟(jì)損失，同時也提醒基層獸醫(yī)同仁在臨床診斷時要慎之又慎，不能確診的病例要及時送實驗室進(jìn)行檢測，爭取最佳治療時機(jī)，避免誤診。

表1 生化試驗結(jié)果