黃博珅

（廣東華大法醫(yī)物證司法鑒定所，廣東 深圳）

0 引言

法醫(yī)物證學(xué)是以法醫(yī)物證為研究對(duì)象，以提供科學(xué)證據(jù)為目的，研究應(yīng)用生命科學(xué)技術(shù)解決案件中與人體有關(guān)的生物檢材鑒定的一門學(xué)科[1]；法醫(yī)物證鑒定，就是從生物檢材的角度，比對(duì)與案件有關(guān)的DNA進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定，是依據(jù)遺傳學(xué)理論，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行生物檢測(cè)，分析判斷個(gè)體生物學(xué)特征，為刑偵案件和司法實(shí)踐提供證據(jù)[2]。本文，通過(guò)對(duì)DNA技術(shù)的發(fā)展與實(shí)踐應(yīng)用的論述分析，探析DAN鑒定在法醫(yī)物證學(xué)中的實(shí)踐方法。

1 DnA鑒定技術(shù)分型

作為法醫(yī)物證學(xué)取證的重要方法，DNA鑒定技術(shù)包括DNA STR分型技術(shù)、minSTR技術(shù)、單核苷酸多態(tài)分型技術(shù)、線粒體DNA等，是目前廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)中的鑒定方法，是包括刑事案件偵破、司法鑒定等進(jìn)行科學(xué)取證的重要途徑[3]。

1.1 DnA STR分型

STR是存在于人類基因組DNA中的一類具有長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA序列，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證檢驗(yàn)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定的豐富來(lái)源；分析STR位點(diǎn)的多態(tài)性，已成為法醫(yī)學(xué)上個(gè)體識(shí)別和親子鑒定主要技術(shù)方法。該技術(shù)是通過(guò)對(duì)毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等生物學(xué)樣本進(jìn)行DNA提取，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶酶切、電泳分離和同位素標(biāo)記的重復(fù)DNA雜交，對(duì)每個(gè)個(gè)體特異的放射自顯影帶型進(jìn)行分析鑒別[4]。STR分型檢測(cè)方法包括銀染法和熒光法，熒光自動(dòng)分析法進(jìn)行STR位點(diǎn)分型具有用時(shí)少、靈敏度和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為STR分型的主要方法；但該方法對(duì)設(shè)備和試劑要求較高、費(fèi)用昂貴，也是制約該方法廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn)。

1.2 minSTR技術(shù)

minSTR技術(shù)主要應(yīng)用于對(duì)微量生物組織或者生物組織已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重降解時(shí)的檢測(cè)，主要用于對(duì)常規(guī)STR基因座檢測(cè)的補(bǔ)充；該檢測(cè)方法通過(guò)減少的STR位點(diǎn)增多片斷進(jìn)行檢測(cè)，一般只需使片斷維持在100bp即可獲得較理想的檢測(cè)結(jié)果、提高等位基因的檢出率。但該檢測(cè)方法只能將少部分基因座增擴(kuò)，STR分型結(jié)果可由于minSTR引物與過(guò)去引物結(jié)合大量堿基缺少或插入而存在差異，因此存在著實(shí)際應(yīng)用中的局限[5]。

1.3 單核苷酸多態(tài)性分析

單核苷酸多態(tài)性分析（single nucleotide polymorphisms，SNP）是基因組上單個(gè)核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、數(shù)量多的特點(diǎn)，廣泛地存在于人類基因組中，是可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種。人體的表型差異及對(duì)藥物或疾病的易感性均與SNP相關(guān)，因此SNP成為第三代遺傳標(biāo)志，廣泛應(yīng)用于高危群體發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因鑒定、藥物設(shè)計(jì)測(cè)試等；法醫(yī)證物學(xué)中，SNP技術(shù)主要用于群體災(zāi)難中的個(gè)體檢驗(yàn)判斷。目前的SNPs檢驗(yàn)技術(shù)主要包括變性梯度凝膠電凝、引物延伸技術(shù)與飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)等，但種類SNP檢測(cè)技術(shù)均需要較為復(fù)雜的設(shè)備，致使該技術(shù)在法醫(yī)物證學(xué)中的應(yīng)用受限于相關(guān)設(shè)備制造和研發(fā)，需要依賴相關(guān)設(shè)備、儀器的發(fā)展而逐步推廣應(yīng)用[6]。

1.4 線粒體DnA

線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）是線粒體中的遺傳物質(zhì)，是在細(xì)胞線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖核酸特殊形態(tài)，一個(gè)線粒體中一般有多個(gè)DNA分子；線粒體主要通過(guò)卵細(xì)胞傳遞，以母系遺傳為主要遺傳形式。mtDNA所有基因位于一個(gè)單一環(huán)狀DNA分子，遺傳物質(zhì)不為核膜包被、不為蛋白質(zhì)壓縮，一些堿基為重疊基因，其存活時(shí)間長(zhǎng)、不易降解，因此適用于確認(rèn)家庭關(guān)系，法醫(yī)物證學(xué)中主要應(yīng)用該方法進(jìn)行微量或缺乏核DNA的檢測(cè)。但線粒體DNA檢測(cè)中，線粒體DNA具有異質(zhì)性，會(huì)出現(xiàn)兩種或兩種以上類型的對(duì)mtDNA，因此在法醫(yī)物證學(xué)應(yīng)用該方法進(jìn)行親子鑒定時(shí)，應(yīng)針對(duì)其穩(wěn)定性差的特點(diǎn)，對(duì)鑒定結(jié)果需要進(jìn)一步證實(shí)[7]。

2 多位點(diǎn)DnA指紋技術(shù)

多位點(diǎn)DNA指紋技術(shù)是指利用個(gè)體特異的DNA多態(tài)性，同人體核DNA的酶切片段雜交、獲得多個(gè)位點(diǎn)的等位基因組成的、長(zhǎng)度不等的雜交帶圖紋，以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別及親子鑒定，因該圖紋的重復(fù)率極低、識(shí)別力高，甚至超過(guò)手指指紋的個(gè)體識(shí)別能力，因而稱為多位點(diǎn)DNA指紋。

多位點(diǎn)DNA指紋分析運(yùn)用DNA指紋圖譜分析方法多樣，包括RFLP（限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性）分析、串聯(lián)重復(fù)序列分析、RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）分析等；檢驗(yàn)檢測(cè)材料多樣，包括精液、陰道分泌物、血液、毛發(fā)等各種核細(xì)胞，且該檢測(cè)方法操作復(fù)雜、每個(gè)環(huán)節(jié)的操作均對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有影響[8]，因此對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)的操作都有較高的要求：（1）對(duì)檢測(cè)材料，要求其中要有足量的高分子量DNA、且比值需在1.8左右；而在進(jìn)行提取操作時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)操作規(guī)范實(shí)施，避免因動(dòng)作過(guò)大使DNA大分子斷裂。（2）在進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化DNA操作時(shí)，需要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行操作，對(duì)酶和樣品、緩沖液體應(yīng)充分混勻；甘油濃度要控制在5%以下，以避免因不當(dāng)操作而導(dǎo)致污染DNA、令DNA被剪切、或者出現(xiàn)抑制酶解等，出現(xiàn)DNA指標(biāo)圖譜錯(cuò)誤。（3）在實(shí)施DNA瓊脂凝膠電泳分離操作時(shí)，應(yīng)確保凝膠板膠厚小于4mm，并將凝膠板在4℃冰箱內(nèi)放置30min；當(dāng)電泳高于室內(nèi)溫度時(shí)，可提高降低電壓、電流，適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，以避免因熱量散發(fā)不及時(shí)而導(dǎo)致凝膠變形、使電泳遷移頻率加快，降低分離效果。（4）要保證真空轉(zhuǎn)移的高效、高速，在清除膠布底泡沫時(shí)，必須確保動(dòng)作輕緩，防止轉(zhuǎn)移和清除動(dòng)作過(guò)大而使譜帶變形。（5）在采取非同位素探針標(biāo)記時(shí)，應(yīng)將探針溶液稀釋，在熱變性5min后放入冰浴中，并用等體積標(biāo)記試劑，放入全部物質(zhì)并充分總合，做好水浴反應(yīng)，以確保標(biāo)記效率和雜交成功率。（6）非同位素雜交膜洗脫過(guò)程中，要針對(duì)背景清晰度，在更換溶液時(shí)，每次均使用濾紙吸收干凈濾膜；沖洗X線片操作過(guò)程中，顯影液使用次數(shù)水少于10次、存放時(shí)間需低于30d、顯影條件溫度為20℃。

例如在強(qiáng)奸案中使用DNA指紋圖檢驗(yàn)，首選在現(xiàn)場(chǎng)提取檢驗(yàn)材料，從檢驗(yàn)材料中提取精子，如出現(xiàn)DNA酶解不開(kāi)或酶無(wú)法完全解開(kāi)，其主要原因包括以下幾個(gè)方面：DNA溶液濃度不準(zhǔn)確或DNA用量過(guò)多，酶量過(guò)少；混合斑載體混入了面料、泥土等，使DNA中融入其他小分子，抑制酶從而導(dǎo)致酶解不開(kāi)，此時(shí)應(yīng)將溶液充分搖勻，提高DNA量予以解決。進(jìn)行同一樣品不同酶解時(shí)間檢驗(yàn)時(shí)，不完全酶解與完全酶解的DNA樣品指紋圖譜具有一定差異，實(shí)際操作時(shí)需要準(zhǔn)確挨近酶解時(shí)間，并隨DNA量增加適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，以保證酶解的有效率。

綜上，DNA鑒定技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，為法醫(yī)物證學(xué)的實(shí)踐提供了一條重要途徑，也必將隨著自身技術(shù)的提升而進(jìn)一步促進(jìn)法醫(yī)物證學(xué)的發(fā)展而不斷完善。