NexGard 中阿福拉納提取與純化工藝研究

趙晶晶

（山西省畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心太原 030027）

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對(duì)生活品質(zhì)的要求日益提高，越來(lái)越多家庭加入科學(xué)養(yǎng)寵隊(duì)伍，據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)目前中國(guó)在冊(cè)的寵物犬?dāng)?shù)量已超7,500 萬(wàn)，其中，城鎮(zhèn)地區(qū)養(yǎng)犬量超5,500 萬(wàn)只[1,2]。然而，寵物犬好動(dòng)，喜歡到處玩耍、聞舔，極易感染寄生蟲病、皮膚病、傳染性疾病等，其中以寄生蟲病最為多發(fā)。常見(jiàn)的體外寄生蟲有蜱蟲、跳蚤等，體內(nèi)寄生蟲有心絲蟲、蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲等，不僅影響寵物的身心健康，還因繁殖力強(qiáng)而污染環(huán)境，進(jìn)而給人的健康帶來(lái)隱患；此外，也極大地減弱寵物主與寵物的親密接觸意愿，因此，防治寵物犬寄生蟲病尤為重要[3,4]。

臨床上，寵物犬體內(nèi)寄生蟲病的防治主要依賴大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，應(yīng)用最為廣泛的有伊維菌素、塞拉菌素、莫昔克丁、米爾貝肟等。近年來(lái)，藥物化學(xué)家們依次發(fā)現(xiàn)幾種新型異噁唑啉類小分子化合物對(duì)犬跳蚤和蜱蟲等體外寄生蟲有突出的藥理活性，如阿福拉納（a foxolaner）[5]、氟雷拉納（fluralaner）[6]、沙羅拉納（sarolaner）[7]和洛替拉納（lotilaner）[8]（結(jié)構(gòu)如圖1所示），該類藥物擬通過(guò)抑制GABA氯離子通道，使節(jié)肢動(dòng)物神經(jīng)高度興奮導(dǎo)致死亡，是強(qiáng)效殺蟲劑。2017年8月，勃林格殷格翰宣布其針對(duì)跳蚤和蜱蟲兩類寄生蟲的犬用口服驅(qū)蟲藥“尼可信”（NexGard，商品名為阿福拉納咀嚼片[9]）在中國(guó)上市，次年8月又宣布首個(gè)犬用口服體內(nèi)外寄生蟲同驅(qū)產(chǎn)品“超可信”（NexGardSpectra，商品名為阿福拉納米爾貝肟咀嚼片）在中國(guó)上市。這兩款寵物藥很快在中國(guó)寵物市場(chǎng)占領(lǐng)了一席之地，消費(fèi)者反饋良好。我國(guó)很多新藥研發(fā)機(jī)構(gòu)也紛紛加入這兩款藥物的自主研發(fā)，期望以“阿福拉納”為敲門磚，啟發(fā)開拓異噁唑啉類活性物質(zhì)研發(fā)思路。

我國(guó)關(guān)于阿福拉納的各項(xiàng)研究均處于萌芽階段，化合物的合成及純化、成品的質(zhì)量研究及藥理毒理研究均未取得較理想的成果。造成這一難題無(wú)法向前推進(jìn)的一個(gè)基本原因，就是無(wú)法取得對(duì)照品或高純度樣品，使得現(xiàn)有研究成果可靠性、科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性都十分不足，包括結(jié)構(gòu)確證、分析方法等研究方面均無(wú)法準(zhǔn)確定位。陳春青等人[10]早前發(fā)明了同類產(chǎn)品“氟雷拉納（fluralaner）咀嚼片”中提取并純化主成分的方法，滿足了前期對(duì)較純化合物的量的需求，并為后期檢驗(yàn)工作提供了參考。目前，阿福拉納對(duì)照品暫無(wú)銷售渠道，本試驗(yàn)或能參考此專利方法，試從上市制劑“尼可信”中提取出阿福拉納化合物，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分離純化從而得到高純度產(chǎn)品，純度檢測(cè)采用薄層色譜和高效液相色譜法相結(jié)合，該研究?jī)?nèi)容國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。Zhuang 等人[11]運(yùn)用手性HPLC 法對(duì)阿福拉納作了大量分析，這為本方法中HPLC 法的建立提供了基礎(chǔ)依據(jù)。本方法能夠快速解決短期內(nèi)因合成工藝復(fù)雜而無(wú)法取得一定需求量的化合物（純度符合要求，不低于99%），也能為后期關(guān)于該藥物藥動(dòng)、藥代學(xué)研究樣品前處理方法中的幾項(xiàng)參數(shù)確定提供研究思路，如組織中藥物提取溶劑、方法、萃取溶劑等。

圖1 四種獸醫(yī)臨床常用的異噁唑啉類驅(qū)蟲藥

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 材料與試劑阿福拉納咀嚼片（梅里亞有限公司法國(guó)吐魯茲生產(chǎn)廠，規(guī)格：136mg）；100～200 目層析硅膠、磷酸、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚（國(guó)藥試劑，AR）；乙腈（HPLC）。

1.1.2 主要儀器萬(wàn)能粉碎機(jī)、磁力攪拌器、反應(yīng)瓶、油浴鍋、冷凝管、水泵、布氏漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、層析柱、微量進(jìn)樣器、硅膠板G254、紫外分析儀、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、超純水儀、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、紅外光譜儀、核磁共振波譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粉碎取60 粒阿福拉納咀嚼片，約300g，置于萬(wàn)能粉碎機(jī)中，粉碎成小顆粒狀，備用。

1.2.2 提取取粉碎后樣品約10g （相當(dāng)于2 粒阿福拉納咀嚼片，含C26H17ClF9N3O3約272mg），加入提取溶劑（從4 種常用溶劑中篩選），開啟攪拌，加熱至回流，抽濾。濾渣同法進(jìn)行二次提取，合并濾液，照薄層色譜法進(jìn)行TLC 點(diǎn)板，在紫外分析儀254nm 處檢測(cè)，判定主斑點(diǎn)深淺及雜質(zhì)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)及深淺，粗略判定純度；然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至干，得粗品（TLC 純度不低于85%）。

1.2.2.1 溶劑的選擇分別選擇4 種常用溶劑（包括二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、石油醚）按1.2.2 項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)提取溶劑。

1.2.2.2 溶劑量的確定分別加入樣品的10 倍、20 倍、30 倍體積質(zhì)量比的1.2.2.1 項(xiàng)篩選出的最優(yōu)提取溶劑，照1.2.2 項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取溶劑量。

1.2.2.3 回流時(shí)間的確定在樣品中加入1.2.2.1 項(xiàng)和1.2.2.2項(xiàng)擇出的最優(yōu)溶劑種類及溶劑量，照1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn)，分別回流1h、2h、3h，篩選出最合適的回流時(shí)間。

1.2.3 分離純化取定量粗品進(jìn)行柱層析分離，濕法上樣，以二氯甲烷/ 甲醇（40:1，v/v）為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并即時(shí)進(jìn)行紫外分析，待分析結(jié)果顯示有目標(biāo)單體時(shí)（粗品點(diǎn)板主斑點(diǎn)Rf值作為參考對(duì)照），開始收集洗脫液并做標(biāo)記，至分析結(jié)果無(wú)目標(biāo)物時(shí)，結(jié)束收集，合并所有標(biāo)記的洗脫液，濃縮至干，得產(chǎn)品（TLC純度不低于95%）。

1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定取樣品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成5μg/mL 的溶液，在200～600nm 測(cè)定吸光度，供試品在312nm 附近有最大吸收。

1.2.5 純度測(cè)定建立HPLC 檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，按面積歸一化法計(jì)算純度。

1）色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，推薦AgilentZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；以0.05%磷酸溶液（pH 2.4）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為312nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為20μL。

表1 流動(dòng)相梯度

2）分析方法：取純化后樣品適量，精密稱定，加流動(dòng)相超聲溶解并定容制成5μg/mL的溶液，搖勻。精密量取20μL注入液相色譜儀，按面積歸一化法以峰面積計(jì)算。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配制2、4、5、10 和20μg/mL的對(duì)照樣品供試液，依次進(jìn)樣，得到色譜圖，按面積歸一化法，用峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸分析。

4）精密度：取對(duì)照樣品溶液（5μg/mL）連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

5）溶液穩(wěn)定性：將對(duì)照樣品溶液（5μg/mL）分別于0、2、4、6、8、12 和24h 取樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

6）重現(xiàn)性：稱取對(duì)照樣品6 等份，配制為5μg/mL，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

7）準(zhǔn)確度：稱取3 份對(duì)照樣品，分別配制為4、5 和6μg/mL，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率及RSD。

1.2.6 結(jié)構(gòu)確證依次通過(guò)紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振氫譜（1HNMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

2.1.1 不同提取溶劑對(duì)提取效率的影響由表2 可知，二氯甲烷的提取效率最好，因此二氯甲烷為本試驗(yàn)最優(yōu)提取溶劑。

表2 不同溶劑對(duì)提取結(jié)果的影響

2.1.2 不同溶劑量對(duì)提取效率的影響采用二氯甲烷按1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn)，分別吸取部分提取液稀釋至同一比例后再進(jìn)行TLC 點(diǎn)板，結(jié)果顯示20 倍、30 倍體積比的二氯甲烷提取效率較好（表3），考慮到經(jīng)濟(jì)環(huán)保，最終選擇20 倍體積比二氯甲烷為最優(yōu)提取溶劑量。

表3 不同溶劑量對(duì)提取結(jié)果的影響

2.1.3 不同回流時(shí)間對(duì)提取效率的影響采用20 倍體積比的二氯甲烷按1.2.2 項(xiàng)提取方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示回流2h、3h 后的提取效率較好（表4），考慮到操作效率，最終選擇回流2h 為最優(yōu)回流時(shí)間。

表4 不同回流時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

2.2 分離純化結(jié)果

由表5 可知，采用20 倍體積比的二氯甲烷提取，回流2h 后進(jìn)行柱層析分離純化的效率可觀，3 批次提取純化的阿福拉納提取率均達(dá)到80%，TLC 點(diǎn)板顯示無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)，主斑點(diǎn)深，說(shuō)明提取物純度極高。

表5 提取純化結(jié)果

2.3 樣品中阿福拉納純度測(cè)定

本試驗(yàn)經(jīng)多次條件摸索，最終建立了高效液相色譜法測(cè)定阿福拉納純度，該方法經(jīng)系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證，準(zhǔn)確度良好，4、5 和6μg/mL濃度的回收率分別為99.55%、99.34%和99.86%；精密度高，連續(xù)進(jìn)樣，主峰峰面積RSD 低于2.0%，重現(xiàn)性好；在2～20μg/mL呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（r>0.999）。

3 批次提取純化樣品的純度測(cè)定結(jié)果分別為99.52%、99.26%和99.31%（圖2），達(dá)到藥物研發(fā)工作對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度需求。

圖2 阿福拉納（3 批次）液相圖譜

2.4 樣品中阿福拉納的結(jié)構(gòu)確證

本試驗(yàn)提取純化的阿福拉納經(jīng)紅外光譜、質(zhì)譜及核磁共振光譜法分別分析鑒定，圖譜見(jiàn)圖4～6，其特征結(jié)構(gòu)由以下特征數(shù)據(jù)確證：

1）紅外光譜[IR(KBr)，ν(c m-1)]：3305，1694，1653，1529，1331，1306，1277，1240，1169，1137c m-1。

圖3 阿福拉納結(jié)構(gòu)

2）質(zhì)譜[ESI-MS(m/z)]：648.2[M+Na]+。

3）核磁共振氫譜[1HNMR（300MHz，DCl3），δ（p p m）]：1H NMR（300MHz，DMSO-D6），δ（p p m）：8.95 （t，1H），8.84（d，1H），8.74 （t，1H），8.40 （d，1H），8.10 （d，2H），7.93（d，2H），7.75-7.04（m，3H），4.64（s，2H），4.08-4.00（m，4H）。

3 討論

本試驗(yàn)確定的提取方法操作簡(jiǎn)便，所用試劑易得且可回收，提取率達(dá)到80%；提取產(chǎn)物經(jīng)純化后，產(chǎn)品純度達(dá)到99%，顯示提取與純化方法符合高效便捷的實(shí)際應(yīng)用要求。本試驗(yàn)中建立的純度檢測(cè)方法可靠，準(zhǔn)確度和精密度均符合獸藥檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。此外，本試驗(yàn)還對(duì)國(guó)內(nèi)不同廠家提供的阿福拉納原料進(jìn)行了較系統(tǒng)全面的質(zhì)量研究，各家產(chǎn)品僅在純度控制上有差異，這與合成工藝的不同息息相關(guān)，后期對(duì)雜質(zhì)的控制與研究應(yīng)進(jìn)一步加深。

阿福拉納目前在國(guó)外已被廣泛應(yīng)用，我國(guó)引入后應(yīng)用反饋也十分滿意，但國(guó)內(nèi)關(guān)于阿福拉納的各項(xiàng)研究均處于起步階段，相關(guān)報(bào)道也甚少。根本原因?yàn)榘⒏＠{進(jìn)口對(duì)照品價(jià)格昂貴，難于獲得且合成難度大，因此，本試驗(yàn)提供的快速獲得高純度的原料方法將為我國(guó)自主研發(fā)阿福拉納及其相關(guān)類型的新藥提供新思路與動(dòng)力。本試驗(yàn)建立的提取方法也可為阿福拉納制劑研究及藥代動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中樣品前處理方法的建立打下基礎(chǔ)，建立的高效液相色譜法為之后該藥物系統(tǒng)的質(zhì)量研究工作具有重要指導(dǎo)意義。

圖4 阿福拉納紅外光譜圖

圖5 阿福拉納質(zhì)譜圖

圖6 阿福拉納核磁氫譜圖