富血小板血漿在色素性皮膚病中的應(yīng)用進(jìn)展

王 涌，童學(xué)婭，周興雯，歸 冰，田文傲，馬 晶，胡海彥，常心通

1 介紹

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）起源于70 年代，1977 年Harke 等[1]首次將全血分離制備出PRP，并且將其用于心臟外科手術(shù)患者，獲得較好效果。1984 年Okuda 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PRP 中含有多種生長因子，且能促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。Matras[3]首次將纖維蛋白凝膠應(yīng)用于口腔與頜面的外科修復(fù)中。Marx 等[4]將PRP 凝膠應(yīng)用到頜面手術(shù)骨骼的修補(bǔ)中。自此以后，PRP 在臨床中的研究日益增多，其廣泛應(yīng)用于燒傷、口腔醫(yī)學(xué)、骨科、整形外科等專業(yè)[5-8]。當(dāng)前的研究也表明，PRP 可以刺激皮膚真皮組織中成纖維細(xì)胞的活性，同時(shí)其可以模擬凝血過程，在該過程中，可以釋放相關(guān)因子達(dá)到組織修復(fù)的作用。高濃度的血小板和生長因子（growth factor，GF）可加速組織的愈合過程[9,10]。

血小板作為來自于骨髓巨核細(xì)胞的細(xì)胞碎片，其特征是缺乏細(xì)胞核，每個(gè)血小板含有3 種顆粒，分別是α 顆粒、致密體和數(shù)量不等的溶酶體。其中α 顆粒中富含血管內(nèi)皮活化因子、白細(xì)胞趨化因子、活化因子及組織修復(fù)相關(guān)的生長因子及抗菌肽等300 多種不同的蛋白質(zhì)，它們參與傷口愈合、血管生成和機(jī)體抗感染免疫等多種生理及病理過程[11-13]。致密體中含有高濃度的二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、Ca2+、Mg2+和5-羥色胺。溶酶體含有多種糖蛋白酶，如糖苷酶、蛋白酶和陽離子蛋白及具有殺菌活性的蛋白質(zhì)[11]。這些GF 在血小板活化后釋放到血液中。GF 通過與不同類型的細(xì)胞膜受體結(jié)合后，觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，激活組織再生過程中的特定功能。當(dāng)前研究較多的GF 是血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor，TGF-β），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），表 皮 生 長 因 子（epidermal growth factor，EGF），成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth facter，IGF-1）等。這些GF 通過促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、血管生成等過程來協(xié)助肌肉，肌腱，韌帶等組織的修復(fù)，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)作用[14,15]。

2 PRP的制備

PRP是從全血中分離獲得的血小板濃縮物，其濃度是全血中血小板濃度的3～5倍[16]。當(dāng)前報(bào)道的獲取PRP的幾種方法中，其在獲取方式上無本質(zhì)區(qū)別，通常會在離心力、離心次數(shù)、離心持續(xù)時(shí)間以及血小板活化劑的類型和濃度上有所差別。

離心作為收集PRP 的關(guān)鍵步驟，并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的離心方法。當(dāng)前多采用密度梯度離心法制備PRP，其可分為兩大類：單次離心法和兩次離心法，部分學(xué)者認(rèn)為單次離心就可以達(dá)到效果，但更多研究采用兩次密度梯度離心法。第1 次離心將紅細(xì)胞同血漿和白膜層分離，第2 次離心濃縮血小板，將其與貧血小板血漿進(jìn)行分離[17-19]。目前文獻(xiàn)中表述的兩次離心的速度和時(shí)間差別較大。第1 次離心的離心力為100～900 g，離心時(shí)間4 ～15 min，第2 次離心的離心力400 ～3 000 g，離心時(shí)間8 ～20 min，這也造成了經(jīng)常無法相互比較所獲取的PRP 品質(zhì)，進(jìn)而無法相互比較其治療效果，給臨床及科研帶來了較大的難題[20-22]。一般來講，增加離心力和離心時(shí)間，可以增加PRP 中血小板的濃度，但是過度的提高離心速度，可能造成血小板激活而降低使用效果[23]。同時(shí)過高的溫度會導(dǎo)致血小板的提前激活，所以，美國血庫學(xué)會（American Association of Blood Banks，AABB）推薦 PRP 的離心溫度為21 ～24℃。宣力等[24]介紹其利用兩次離心法分離PRP 的方法，具體如下：將血液收集到離心管中，第1 次離心轉(zhuǎn)速1 500 r/min（377 g），離心10 min。離心后血液分為3 層：上層為貧血小板血漿或乏血小板血漿（poor platelet plasma，PPP），中層為黃衣層，即為濃縮的血小板，下層為紅細(xì)胞。用吸管吸取上層、中層以及鄰近中層的部分紅細(xì)胞，并將其移入另一無菌離心管中；第2 次以 3 000 r/min（1 509 g）、離心20 min。離心后離心管中液體分為兩層，用吸管吸取上層約3/4 的PPP，下層即為PRP。將PRP 重懸、充分混勻，并對其分離出來的血小板進(jìn)行血常規(guī)檢測，顯示出良好的分離效果。

對于血小板激活劑的選擇，一般使用氯化鈣，葡萄糖酸鈣或凝血酶。關(guān)于這一步驟，Gómez 等[25]建議將比例為1:20（v/v）的10%氯化鈣溶液進(jìn)行激活。Vahabi 等[26]使用葡萄糖酸鈣作為激活劑，通過比較激活的PRP 和未被激活的PRP 對體外成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖能力測定發(fā)現(xiàn)，活化的PRP 對細(xì)胞增殖的影響要高于未活化的PRP，然而兩者間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)限于其樣本量較少，仍需進(jìn)一步研究。此外，沒有確切的研究證實(shí)PRP 激活的時(shí)間與PRP 療效之間關(guān)系的研究。Marx[27]研究提示，制備好的PRP，其可以穩(wěn)定保存8 h。但是，血小板一旦被激活，其會在最初的10 min 內(nèi)會釋放70%的相關(guān)因子。這表明如果激活了PRP，則應(yīng)盡快應(yīng)用。否則，組織愈合過程中所需的GF 將會丟失。

3 PRP在色素性皮膚病中的應(yīng)用

3.1 PRP 在白癜風(fēng)中的應(yīng)用

白癜風(fēng)作為是一種常見的自身免疫性疾病，同時(shí)作為一種損容性皮膚病，對患者的心理造成了不良影響，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。綜合來說，白癜風(fēng)的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用引起皮膚黑素細(xì)胞被自身免疫系統(tǒng)攻擊損傷造成的結(jié)果。目前白癜風(fēng)的治療方法雖然較多，但其療效常常欠佳，且很多治療方法缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)。近年來隨著對白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的不斷探索，一些新的治療方法也在不斷地得到應(yīng)用。PRP 作為治療白癜風(fēng)的一種有效方法也得到了不斷的應(yīng)用。

3.1.1 光療結(jié)合PRP 治療白癜風(fēng) 目前308 nm 準(zhǔn)分子激光和311 nm 窄譜中波紫外線（narrow-band ultraviolet，NB-UVB）等光療技術(shù)在白癜風(fēng)患者中的療效日益得到認(rèn)可。

當(dāng)前使用自體PRP 皮下微針注射聯(lián)合光療在穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者中已經(jīng)取得較大進(jìn)展。Abdelghani等[28]在其研究中發(fā)現(xiàn)自體PRP 皮下微針注射聯(lián)合NB-UVB 光療可以顯著縮短白癜風(fēng)患者治療的總時(shí)間。Khattab 等[29]將308 nm 準(zhǔn)分子激光聯(lián)合PRP 對穩(wěn)定期非節(jié)段性白癜風(fēng)患者進(jìn)行治療，取得了良好的效果。發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)合可以有效提高白斑復(fù)色率，縮短了治療時(shí)間，避免了長期使用308 nm 準(zhǔn)分子激光照射的不良反應(yīng)。李嘉等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，使用自體PRP 微針注射聯(lián)合308 nm 準(zhǔn)分子激光治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，獲得了較好的療效。其共納入40 例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，獲得80 片皮損，分為觀察組和對照組，所有患者皮損均予他克莫司軟膏每日1 次外用，308 nm 準(zhǔn)分子激光照射治療，每周2 次，觀察組另外給予自體PRP 每3 周1 次皮內(nèi)微針注射，對照組給予生理鹽水注射，連續(xù)治療3 個(gè)月后對皮損區(qū)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示觀察組顯效率77.50%，對照組顯效率為52.50%，觀察組顯效率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組不同部位皮損療效比較結(jié)果顯示，其在面頸部和軀干部的療效最佳，肢端療效最差。這些研究均提示PRP 與光療聯(lián)合是一種治療白癜風(fēng)的有效方法。但是，Ibrahim 等[31]研究也提示，單用PRP 治療白癜風(fēng)的療效不佳。而Kadry 等[32]將PRP 聯(lián)合二氧化碳點(diǎn)陣激光治療白癜風(fēng)的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，PRP 聯(lián)合二氧化碳點(diǎn)陣激光及單用PRP 均取得了良好的復(fù)色效果，其中以PRP聯(lián)合二氧化碳點(diǎn)陣激光復(fù)色效果最好，單用PRP 白斑部位取得了中等程度的復(fù)色，單用PRP 的復(fù)色效果優(yōu)于單用二氧化碳點(diǎn)陣激光治療白癜風(fēng)的效果。

3.1.2 手術(shù)聯(lián)合PRP 治療白癜風(fēng) 白癜風(fēng)是一類以色素脫失為特點(diǎn)的色素障礙性疾病。常規(guī)治療方式包括藥物治療、光療或手術(shù)治療或者聯(lián)合多種治療方式等。對于穩(wěn)定期白癜風(fēng)及常規(guī)治療效果不佳的患者，外科治療可作為首選干預(yù)措施[33]。其中，表皮細(xì)胞混懸液移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)具有療效肯定、治療面積大、價(jià)格較低等優(yōu)點(diǎn)。已被廣泛應(yīng)用于白癜風(fēng)的治療，效果令人滿意，被認(rèn)為是簡單、安全的技術(shù)。

Garg 等[34]使用PRP 作為表皮細(xì)胞的懸浮劑，同時(shí)使用Er:YAG 激光對白斑部位進(jìn)行磨削，在治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者中取得良好的治療效果。該項(xiàng)研究共納入10 例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，獲取20 個(gè)皮損部位。在20 個(gè)皮損區(qū)域，有12 個(gè)皮損區(qū)域（60%）出現(xiàn)完全的色素恢復(fù)，2 個(gè)皮損區(qū)域（10%）出現(xiàn)較大面積的色素恢復(fù)，4 個(gè)（20%）表現(xiàn)出中度色素恢復(fù)，以及2 個(gè)皮損區(qū)域（10%）無明顯改善。腿部、膝關(guān)節(jié)、面部和頸部恢復(fù)最為明顯，而肢端的恢復(fù)效果較差。Nimitha 等[35]使用PRP 懸浮表皮細(xì)胞制備成懸浮液與使用磷酸鹽緩沖液懸浮的表皮細(xì)胞混懸液進(jìn)行對比，觀察兩者在穩(wěn)定性白癜風(fēng)患者中的色素恢復(fù)。納入21 例穩(wěn)定期的白癜風(fēng)患者，獲取42 片白斑。白癜風(fēng)病變的平均穩(wěn)定時(shí)長為4.5 年。多數(shù)患者在治療后的1 ～3 個(gè)月左右出現(xiàn)小圓形至橢圓形離散的色素恢復(fù)。在隨訪的6 個(gè)月中，PRP 組的平均色素恢復(fù)為75.6%，非PRP 組的平均色素恢復(fù)為65%。PRP 組和非PRP 組之間的色素恢復(fù)面積比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PRP 組顯示出更好的色素恢復(fù)。在分析節(jié)段型白癜風(fēng)患者中的色素恢復(fù)率時(shí)，無論是PRP 組還是非PRP 組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，在非節(jié)段型白癜風(fēng)患者中，PRP 組相比非PRP 組顯示出更好的治療效果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。該項(xiàng)研究提示將未培養(yǎng)的表皮細(xì)胞懸浮于PRP 中比懸浮在磷酸鹽緩沖液中可以更顯著的提高白癜風(fēng)患者皮損區(qū)的平均色素恢復(fù)。

以上研究的結(jié)果表明，使用PRP 作為表皮細(xì)胞的懸浮液可以顯著改善白癜風(fēng)患者的手術(shù)效果，促進(jìn)白斑部位的早期色素恢復(fù)，更好的治療白癜風(fēng)。然而，仍需要進(jìn)行更加嚴(yán)格的隨機(jī)對照試驗(yàn)（randomized controlled trial，RCT）來確定該技術(shù)的有效性和安全性。

當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者白斑皮損處刺激黑素細(xì)胞活性的因子，如粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子水平明顯下降[36,37]。同時(shí)，Shi 等[38]發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子通過激活磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶-Ras相關(guān)的C3 肉毒素底物1-黏附斑激酶-c-Jun N 末端激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/Serine/threonine kinase-Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1-Focal adhesion kinase-c Jun N-terminal kinase，PI3K/Akt-Rac1-FAK-JNK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移，血小板在激活過程中可以釋放多種生長因子；PRP 中含有的多種生長因子能夠改善白癜風(fēng)患者皮損處的微環(huán)境，更好的促進(jìn)移植后表皮細(xì)胞的成活和皮損部位的色素恢復(fù)。

3.2 PRP 在黃褐斑中的應(yīng)用

黃褐斑（melasma）是一種面部獲得性色素增加性皮膚病，多發(fā)生于頻繁暴露于紫外線下膚色較深的女性面部。皮損常分布對稱，發(fā)展緩慢，可持續(xù)多年。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療困難，易復(fù)發(fā)[39]。當(dāng)前，黃褐斑的治療多采用聯(lián)合治療的方法，包括：系統(tǒng)藥物治療、局部藥物治療、化學(xué)剝脫、物理治療、中醫(yī)中藥治療等方法。

3.2.1 皮下注射PRP 治療黃褐斑 雖然黃褐斑的治療手段多樣，但患者的療效并不十分滿意，且停止治療后易復(fù)發(fā)。并且口服藥物如氨甲環(huán)酸和谷胱甘肽，可能導(dǎo)致腹脹，月經(jīng)周期紊亂，頭痛，甚至深靜脈血栓的形成[40]。探索出治療黃褐斑新的治療方法，是當(dāng)前黃褐斑研究的重要方向。

當(dāng)前有研究報(bào)道使用PRP 可以顯著改善黃褐斑患者皮損狀況。Cay?rl? 等[41]報(bào)道了1 例27 歲的女性，每隔15 d 進(jìn)行1 次PRP 的皮下微針注射，在第3 次PRP 治療結(jié)束時(shí)，觀察到表皮色素恢復(fù)面積＞80%，且6 個(gè)月內(nèi)無復(fù)發(fā)。同樣，Sirithanabadeekul等[42]使用PRP 治療黃褐斑的有效性進(jìn)行更嚴(yán)格的RCT，進(jìn)一步證實(shí)了皮內(nèi)PRP 注射治療黃褐斑的有效性。Hofny 等[43]通過對黃褐斑患者皮損部位皮下微針注射PRP 后和正常部位使用免疫組化的方法進(jìn)行TGF-β 蛋白表達(dá)的對比發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行PRP 治療之前，黃褐斑患者的皮損部位和皮損部位周圍TGF-β蛋白的表達(dá)顯著低于健康皮膚（P＜0.05）。PRP 治療后，黃褐斑患者的皮損部位TGF-β 蛋白的表達(dá)明顯增加。該現(xiàn)象說明PRP 對黃褐斑患者的改善作用可能通過提高皮損部位的TGF-β 蛋白的表達(dá)達(dá)到對黃褐斑的治療作用。

3.2.2 光電技術(shù)聯(lián)合皮下注射PRP 治療黃褐斑 近年來，隨著光電技術(shù)的不斷發(fā)展，其在黃褐斑的治療中所扮演的角色越來越引起研究者們的重視。當(dāng)前應(yīng)用于治療黃褐斑的激光包括：Q 開關(guān)激光、點(diǎn)陣激光、強(qiáng)脈沖光、溴化亞銅激光等治療措施[44]。其原理是，通過在能量上的選擇針對黑素細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的黑素顆粒進(jìn)行選擇性光爆破，通過低能量、多次光爆破作用使黑素細(xì)胞功能失活或抑制，同時(shí)黑素顆粒的多次光爆破，可以使黑素顆粒更微小化，更有利于被機(jī)體吞噬排出。

蘇碧鳳等[45]通過PRP 水光注射聯(lián)合Q 開關(guān)Nd:YAG 1064nm 激光對黃褐斑進(jìn)行的臨床治療發(fā)現(xiàn)，在納入的100 例黃褐斑患者中，PRP+激光組中基本治愈15 例，顯效22 例，好轉(zhuǎn)11 例，無效1 例；單獨(dú)應(yīng)用激光組中基本治愈8 例，顯效21 例，好轉(zhuǎn)18例，無效3 例，兩組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。彭國凱和宋繼權(quán)[46]對調(diào)Q 激光聯(lián)合PRP治療面部黃褐斑的有效性進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果表明調(diào)Q 激光聯(lián)合PRP 治療面部黃褐斑有療效，但是其具體機(jī)制暫不明確，這為黃褐斑的治療提供了新思路。但是，關(guān)于PRP 聯(lián)合激光在黃褐斑中的治療效果仍需要更嚴(yán)格的RCT 來證實(shí)。

4 展望

根據(jù)當(dāng)前PRP 在色素性皮膚病中的研究可知，PRP 在治療黃褐斑的可能機(jī)制是：PRP 通過增加皮損部位TGF-β 蛋白的表達(dá)起到對黃褐斑患者的改善作用。

而PRP 對白癜風(fēng)患者皮損處的改善作用可能與血小板中的α 顆粒分泌的黏附分子和細(xì)胞因子改善了白癜風(fēng)患者皮損部位的局部微環(huán)境有關(guān)。白癜風(fēng)的發(fā)病與皮損部位的免疫異常密切相關(guān)，李春英和李舒麗[47]研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者的局部免疫異常與皮損部位的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞無法對抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激過程中釋放的多種炎性因子、趨化因子對黑素細(xì)胞造成損傷有關(guān)。而PRP 中分泌的多種血小板生長因子以及血小板釋放的多種抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素（IL）-1 受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1ra）、可溶性腫瘤壞死因子受體（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNF-R）I、IL-4、IL-10，在調(diào)節(jié)皮損部位局部免疫平衡方面可能發(fā)揮了一定的作用[28]。

當(dāng)前，學(xué)者們對于PRP 的效果存在爭議，有大量文獻(xiàn)報(bào)道了PRP 所取得的良好效果，也有文獻(xiàn)報(bào)道PRP 作用有限。但是當(dāng)前的多數(shù)研究并沒有對PRP 的制備及其質(zhì)控方法進(jìn)行詳細(xì)說明，這造成制備出的PRP 質(zhì)量參差不齊，影響了對其療效的觀察。Chahla 等[48]分析了2006—2016 年10 年間的105 項(xiàng)有關(guān)PRP 的研究發(fā)現(xiàn)，僅有10%的研究提供了詳細(xì)的PRP 制備方法，16%的研究提供了PRP 產(chǎn)品具體的量化指標(biāo)。所以當(dāng)前那些認(rèn)為PRP 沒有作用的相關(guān)文獻(xiàn)，部分原因可能是其研究的設(shè)計(jì)、執(zhí)行、評估方法存在不科學(xué)、不嚴(yán)謹(jǐn)造成的，更大的問題可能是制備出的PRP 不合格。也就是同一研究中使用的PRP 不具有均質(zhì)性，造成實(shí)驗(yàn)或臨床效果不穩(wěn)定或缺乏可比性[23]。這也是造成當(dāng)前PRP 在色素性皮膚疾病中的研究出現(xiàn)較大差異的原因之一。因此在應(yīng)用PRP 治療之前，需要對患者的情況進(jìn)行統(tǒng)一評估，同時(shí)對所獲取的血小板數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格的把控，以保證對PRP 療效進(jìn)行更加客觀的評價(jià)。