張小力，劉 芹，劉寶瑞，

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210008；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

腫瘤免疫在惡性腫瘤治療中發(fā)揮了越來越重要的作用，很多傳統(tǒng)的中藥均具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)雙重功能。重樓在我國藥用歷史悠久，其主要功能為清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚等[1]，近年來也因為抗腫瘤作用受到研究人員的重視。研究表明重樓提取物對多種腫瘤細胞的增殖具有良好的抑制效果,其主要的活性成分甾體皂苷可分為兩類:薯蕷皂苷和偏諾皂苷，薯蕷皂苷又可以根據(jù)具體結(jié)構(gòu)的不同分為重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷 Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ和C22-甲氧基-原薯蕷皂苷等[2]。重樓皂苷的抗腫瘤作用可以表現(xiàn)在直接作用于腫瘤細胞，通過介導(dǎo)細胞凋亡或抑制增殖等機制干預(yù)腫瘤生長，例如重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ等具有細胞毒活性。另一方面，重樓皂苷也可能參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，對腫瘤造成間接的抑制、清除作用，重樓皂苷Ⅰ-Ⅲ等被證實具有免疫調(diào)節(jié)活性[3]。下面我們將對重樓皂苷對腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境的作用展開綜述。

1 對腫瘤細胞的直接作用

“瘤”和“癌”字初在古代中醫(yī)典籍中出現(xiàn)時一般指贅生物，東漢《說文解字》解釋“瘤，腫也”，宋代《衛(wèi)濟寶書》提到：“癌疾初發(fā)，卻無頭緒，只是肉熱痛，過一七或二七，忽然紫赤微腫，漸不疼痛，迤邐軟熱，紫赤色，只是不破……”，又有《仁齋直指方論》：“癌者，上高下深，巖穴之狀……毒根深藏，方孔透里”。此外，噎嗝、積聚、失榮等由癥狀描述建立的病名也被認為可能是腫瘤的伴隨癥狀及腫瘤惡液質(zhì)的表現(xiàn)?？梢娭嗅t(yī)對于腫瘤的診治是以外科瘡瘍類疾病的形態(tài)分析為基礎(chǔ)，內(nèi)科雜病的病機辨證為主要思路，以清除毒邪和改善癥狀為主要治療目的。

中醫(yī)認為腫瘤是多種病理因素錯綜交雜的產(chǎn)物，表現(xiàn)為熱毒與痰瘀搏結(jié)于臟腑經(jīng)絡(luò)，在局部形成積塊，因此清熱解毒成為主要的治療方法之一。重樓性味苦寒，是清熱解毒的代表性藥物之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》述其：“主驚癇，搖頭弄舌，熱氣在腹中，癲疾，癰瘡……”，明代《滇南本草》又提到“消諸瘡，無名腫毒”的功用?！夺t(yī)宗金鑒》中有化疔內(nèi)消散，將重樓配伍知母、貝母、天花粉、皂角刺、金銀花等，用于治療疔毒，《醫(yī)方簡義》加減千金牡丹皮飲選擇重樓配伍牡丹皮、瓜蔞仁、金銀花、薏苡仁，主治妊娠一切內(nèi)癰，胃癰酌加川連5錢。重樓的抗腫瘤效果也被現(xiàn)代藥理學(xué)證實，張欣等[4]選擇不同產(chǎn)地的重樓提取有效成分，發(fā)現(xiàn)不同來源的重樓總皂苷均有較好的抑制SW620、HT-29細胞生長活性，其直接抗腫瘤作用的機制主要包括細胞凋亡和周期阻滯。

1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中的細胞器，具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)生物合成和蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運的功能。環(huán)境中出現(xiàn)Ca2+水平改變、營養(yǎng)狀態(tài)、病原體或炎癥刺激等均可導(dǎo)致ER中的蛋白質(zhì)錯誤折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)積累，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在缺氧等惡劣環(huán)境下可以上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)分子伴侶的表達，促進蛋白的折疊并加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)修復(fù)[5]，從而適應(yīng)惡劣環(huán)境并快速生長。張嘉玲等[6]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ可抑制卵巢癌細胞在小鼠體內(nèi)增殖，促凋亡基因以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因GRP78和CHOP表達均顯著增加，證明重樓皂苷誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，并提示凋亡機制可能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)。半胱天冬酶12(Caspase-12)被證明只與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡有關(guān)[7]，陽丹丹等[8]檢測重樓皂苷處理后的肝癌HepG2細胞中IRE-1通路相關(guān)蛋白水平，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ處理后細胞裂解半胱天冬酶12(Cleaved-Caspase-12)水平顯著升高，Caspase-12顯著下降且降低趨勢與Cleaved-Caspase-12升高保持一致，IRE-1水平顯著升高，提示重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡過程中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進一步研究發(fā)現(xiàn)IRE1通路下游的關(guān)鍵蛋白質(zhì)XBP1水平顯著降低，但是促凋亡蛋白質(zhì)CHOP的水平無明顯變化，加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定劑4-PBA后觀測到HepG2細胞凋亡率進一步增加，因而重樓皂苷誘導(dǎo)的細胞凋亡作用不是單純由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的。

以上研究均證實了重樓皂苷誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑相關(guān)，但具體機制仍然存在爭議，實驗結(jié)果的差異一方面可能與細胞種類、選取的皂苷種類相關(guān)，另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程較復(fù)雜，仍有較多機制尚未探明，未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)不僅是腫瘤細胞對環(huán)境的適應(yīng)機制，也有研究發(fā)現(xiàn)UPR活化可抑制細胞周期蛋白D1的翻譯導(dǎo)致細胞周期阻滯[9],在癌癥發(fā)展的初始階段甚至可參與阻止原癌基因誘導(dǎo)的惡性進展[10]。

1.2 線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡 Jacobson等[11]證明線粒體在細胞凋亡中起作用后，越來越多的實驗結(jié)果表明線粒體途徑是介導(dǎo)細胞程序性死亡的重要方式。細胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)是呼吸鏈中的重要載體，分布在線粒體內(nèi)膜上且無法通過外膜，線粒體內(nèi)的Cyt-C出現(xiàn)缺失或功能障礙會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能異常，使ATP水平無法維持從而導(dǎo)致細胞壞死，Cyt-C釋放到胞質(zhì)中還可激活Caspase途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。Bcl-2家族位于線粒體外膜上，包含促進和抑制細胞凋亡兩種類型的蛋白質(zhì)。各種細胞毒性刺激，包括致癌應(yīng)激和化學(xué)治療劑等抑制抗凋亡蛋白，促進促凋亡蛋白例如BAX和BAK，形成能滲透線粒體外膜的寡聚體，細胞凋亡因子由此進入胞漿導(dǎo)致細胞凋亡[13]。

陳舒怡等[14]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ處理過的NCI-H661細胞線粒體快速碎裂，表明重樓的抗腫瘤作用或與線粒體途徑相關(guān)，Zeng等[15]用重樓皂苷I處理HepG2細胞，24 h后活細胞百分率明顯降低，細胞質(zhì)中的Cyt-C水平顯著升高，而線粒體中的Cyt-C水平降低，認為重樓皂苷I改變了線粒體膜通透性，引起細胞線粒體功能障礙誘發(fā)凋亡。Zhou等[16]用重樓皂苷Ⅶ處理抑制HT-29和HCT-116細胞，均檢測到抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下降及促凋亡蛋白BAX水平升高，提示重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能與影響B(tài)cl-2蛋白家族蛋白的表達有關(guān)。

1.3 對腫瘤細胞周期的阻滯 腫瘤細胞的細胞質(zhì)中存在胞質(zhì)微管，微管在細胞分裂前期解聚形成微管蛋白，后續(xù)可進一步聚合成為紡錘體，幫助細胞完成有絲分裂，因此臨床上常用秋水仙堿類和長春堿類藥物干擾紡錘體合成達到抗腫瘤作用[17]。于思等[18]在重樓皂苷Ⅰ處理的HCT116細胞中也觀察到微管結(jié)構(gòu)變化，影響了紡錘體的形成，最終細胞周期停滯于G2/M期。除了破壞微管，Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ以濃度依賴的方式上調(diào)p21的表達，使前列腺癌PC3和DU145細胞出現(xiàn)G0/G1阻滯，這種對p21的調(diào)節(jié)被認為FOXO3信號通路有關(guān)，研究證明FOXO3基因敲除可部分緩解重樓皂苷I誘導(dǎo)的膀胱癌細胞G2/M期阻滯[20]。

上述研究提示了重樓皂苷在聯(lián)合化療中的應(yīng)用潛力，重樓皂苷擁有秋水仙堿類化療藥物破壞有絲分裂的功能并可以通過影響p21表達發(fā)揮細胞周期阻滯作用，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用時還存在較好的增敏效果，但是重樓皂苷對紡錘體形成的干擾作用和對p21相關(guān)通路的影響均缺少更多種腫瘤細胞系的觀察結(jié)果。

2 腫瘤免疫-微環(huán)境

癌毒理論是由毒邪理論發(fā)展出的創(chuàng)新概念，癌毒指內(nèi)外因素誘導(dǎo)下人體臟腑功能失調(diào)、氣血郁滯而產(chǎn)生的特異性致病因子，這一理論強調(diào)了腫瘤形成過程漫長，又因毒致虛糾纏臟腑從而進一步生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的動態(tài)過程[21]。既往實驗及報道中，重樓在自身免疫系統(tǒng)疾病當中存在較好的療效[22]，其免疫調(diào)節(jié)活性值得進一步探究。李春江[23]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷可以使荷瘤小鼠胸腺指數(shù)顯著增加，證明重樓皂苷對胸腺組織起到顯著的保護作用，增加機體的抗腫瘤免疫能力，由此提示重樓皂苷作為抗腫瘤藥物，除直接作用于腫瘤細胞誘導(dǎo)凋亡外，可能存在免疫調(diào)節(jié)的間接抗腫瘤作用。

2.1 免疫細胞 腫瘤微環(huán)境中包含多種免疫細胞，包括巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞等，免疫細胞的低反應(yīng)能力是腫瘤的一大顯著特征[24]，包括增殖數(shù)量、殺傷活性、分泌功能等多個方面，因此增強免疫細胞功能也成為了中藥對免疫調(diào)節(jié)的研究重點。在腫瘤的細胞免疫治療中，重樓皂苷也被證實具有協(xié)同促進作用，細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(Cytokine induced killer，CIK)是一種由多種細胞因子在體外刺激后獲得的異質(zhì)細胞，是非特異性細胞療法的重要組成。實驗發(fā)現(xiàn)重樓皂苷聯(lián)合CIK細胞組的腫瘤抑制率高于單純使用重樓醇提物或CIK細胞治療[25]，因此，重樓皂苷與過繼性免疫治療可能有較好的協(xié)同作用。

2.2 細胞因子 腫瘤免疫微環(huán)境中非特異性免疫因子包括白細胞介素(Interleukin，IL)、趨化因子、干擾素(Interferon，INF)及腫瘤壞死因子等，腫瘤細胞上部分細胞因子和趨化因子呈現(xiàn)出過表達。其中，主要由Th1細胞分泌的IL-2，IFN-γ等，主要介導(dǎo)細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，由Th2細胞分泌的IL-4,IL-5,IL-6和IL-10等與體液免疫有關(guān)，抑制T細胞抗腫瘤免疫，促進了腫瘤細胞免疫逃逸[26]。柴紅妍[27]的體內(nèi)實驗驗證促炎性細胞因子CL-16、CL-17和趨化因子CXCL16及其受體參與調(diào)控肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷粗提取物對相關(guān)受體有顯著抑制作用。滕文靜等[28]的體外實驗觀察到重樓總皂苷對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的抑制，實驗驗證其機制與下調(diào) IL-6的分泌，抑制IL-6/STAT3信號通路有關(guān)。體內(nèi)及體外實驗結(jié)果均展現(xiàn)出重樓皂苷對腫瘤微環(huán)境中細胞因子的作用有顯著的調(diào)節(jié)，對控制腫瘤的局部進展和遠處轉(zhuǎn)移有抑制作用。

2.3 腫瘤血管 持續(xù)的血管生成是惡性腫瘤的特征之一，腫瘤細胞分泌促血管生成因子刺激內(nèi)皮細胞增殖，后續(xù)通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞遷移，進一步形成新的血管系統(tǒng)為腫瘤供能，滿足其進一步生長以及排出代謝廢物和二氧化碳的需要。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是常見的促血管生成因子，由腫瘤細胞、周細胞(包裹在血管內(nèi)皮周圍的一種特殊間充質(zhì)細胞)分泌[24]。胡靜等[29]發(fā)現(xiàn)對肝癌H22荷瘤小鼠用重樓醇提物灌胃治療后，腫瘤組織微血管密度顯著下降。柴紅妍[27]的肺腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)重樓皂苷能夠有效抑制STAT3核轉(zhuǎn)錄因子mRNA的水平，顯著降低VEGF-A和血管間細胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達，通過抗血管生成抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。鄧碧凡等[30]用重樓皂苷Ⅰ干預(yù)低氧喉癌Hep-2細胞后，觀察到HIF-1α、VEGF表達的降低。

新生血管促進了腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，也干擾了抗腫瘤免疫的建立，目前的抗血管生成治療策略很少實現(xiàn)完全的反應(yīng)，KEYNOTE-426、IMBRAAVE 150等臨床試驗證明了抗VEGF藥物聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制聯(lián)合應(yīng)用的有效性[31]，目前針對更多腫瘤類型、更多種抗VEGF藥物靶點的嘗試正在進行。重樓皂苷具有較好的抗血管生成作用，抑制VEGF的表達可能是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制，但具體靶點有待進一步研究，重樓皂苷與抗PD-1抗體是否存在協(xié)同抗腫瘤作用也值得進一步探索驗證。

2.4 細胞外基質(zhì) 細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)是一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白酶，可靶向并降解ECM中多種蛋白。呂蕓等[32]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷D可抑制A549細胞的遷移和侵襲，觀察到MMP-2和MMP-9的表達水平呈濃度依賴性降低，提示重樓皂苷D可能通過抑制MMP對ECM的降解起到間接抗腫瘤作用。李宇華等[33]在重樓皂苷Ⅵ處理過的LoVo細胞實驗中也觀察到MMP-2和MMP-9的表達下調(diào)，證實重樓皂苷在LoVo細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控作用。

重樓皂苷通過下調(diào)MMP的表達抑制ECM降解，從而延緩腫瘤的局部侵襲，也在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境，理性推測重樓皂苷可能與目前在臨床已取得一定療效的免疫治療策略如免疫卡控點抑制劑、過繼性細胞治療、治療性疫苗等具有協(xié)調(diào)作用，是良好的免疫治療增敏劑，值得進一步在臨床前和臨床試驗研究中探索和證實。

3 小 結(jié)

重樓具有一定的抗腫瘤作用，體內(nèi)及體外實驗中對很多腫瘤細胞系均有效，適合臨床應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，且不良反應(yīng)少。重樓皂苷是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分，目前對重樓皂苷抗腫瘤機制的研究大多集中在對多種腫瘤細胞線粒體凋亡途徑的驗證，對于其他機制尤其是具體靶點的研究較少，抗腫瘤作用機制有待進一步實驗挖掘。近年來圍繞著誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞周期阻滯等角度進行的中藥抗腫瘤作用機制研究得到廣泛關(guān)注，中藥單體成分展現(xiàn)出與已知化療藥物類似的細胞殺傷能力，但臨床應(yīng)用方面存在較多障礙，且不能達到完全替代化療藥物的效果。部分細胞毒性化療藥物可以通過誘導(dǎo)免疫原性腫瘤細胞死亡或參與免疫效應(yīng)機制來提高抗腫瘤免疫應(yīng)答[34]，重樓皂苷也具有相似的細胞毒性和對微環(huán)境的修飾能力，中藥直接應(yīng)用于抗腫瘤免疫治療的可行性有待進一步探索。

“顧護正氣”的思想貫穿整個中醫(yī)抗腫瘤治療過程，中藥與免疫治療相結(jié)合擁有良好的臨床應(yīng)用潛力。黃芪根中分離出的黃芪多糖無法對抗腫瘤細胞的直接細胞毒性，但是可以降低腫瘤表面PD-L1表達來刺激宿主免疫從而增強化療藥物療效[35]，雷秦等[36]發(fā)現(xiàn)苦參堿可以加強NK細胞對HL60細胞的殺傷效率，Mo等發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素(中藥斑蝥抗癌主要成分斑蝥素經(jīng)水解去二甲基后的產(chǎn)物)可以減少疫苗治療中腫瘤組織的Tregs(Regulatory T cells)浸潤從而促進抗腫瘤疫苗的療效[37]?！渡菟幮詡湟分刑岬街貥恰把a血行氣，壯精益腎，能消百毒”，《本草求原》也有“益脾汁，升胃之清氣”的論述，都提示重樓皂苷的抗腫瘤應(yīng)用與免疫治療具有廣泛的結(jié)合空間。積極構(gòu)建聯(lián)合治療策略，有助于促進基于中藥創(chuàng)新藥物的研發(fā)和拓寬傳統(tǒng)中藥的臨床應(yīng)用方式。