馬懷芬，龍凱花，朱鳳霞，孟婷婷，王春柳

(1.西安培華學(xué)院，陜西 西安 710125；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安710003)

中風(fēng)是一種存在于臨床中的、普遍的神經(jīng)疾病，主要表現(xiàn)為突然昏厥、患者大部分都會(huì)出現(xiàn)身體正常功能嚴(yán)重受損的后遺癥，即平常所說(shuō)的半身不遂、言語(yǔ)不清。發(fā)病后患者生理變化非常明顯，容易造成殘疾。它主要包括缺血性中風(fēng)以及出血性中風(fēng)兩種。常是因?yàn)檠芏氯斐傻拇竽X血管破裂，從而造成腦組織損傷[1-2]。由于該病復(fù)發(fā)率、病死率、致殘率高，對(duì)中老年的健康及生活質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重威脅，患者存活后，遺留不同程度致殘，常見(jiàn)失語(yǔ)、偏癱和認(rèn)知障礙等臨床表現(xiàn)[3-4]。西醫(yī)臨床常采用組織纖溶酶原激活物治療，但不良反應(yīng)較多，如治療時(shí)間窗短、增加病死率及神經(jīng)毒性等，還采用抗凝藥物治療，但療效不理想。所以，找到更加高效的治療方案以及藥物成為了醫(yī)學(xué)研究目標(biāo)。

中風(fēng)主要是由于內(nèi)虛邪中，陰陽(yáng)失調(diào)，上腦而失清，其受到虛、火、風(fēng)、痰、氣、血等多種因素的影響。在提高存活率、預(yù)后生存質(zhì)量，降低病死率、致殘率等方面，中醫(yī)治療中風(fēng)具有豐富的臨證經(jīng)驗(yàn)。赤芍、牡丹皮均為毛茛科植物,兩者化學(xué)成分類似，均為清熱涼血藥，臨床常相須為用，協(xié)同增效。赤芍性苦，破瘀血，散血塊[5-6]；牡丹皮味酸，破血、行血[7-8]，為中醫(yī)臨床活血化瘀、治療中風(fēng)病常用藥對(duì)，用于血瘀輕癥。但藥對(duì)赤芍-牡丹皮用于治療中風(fēng)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，作用機(jī)理及信號(hào)通路等方面目前仍未闡明清楚。為闡明藥對(duì)的作用機(jī)制，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其可能的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要從分子與基因水平兩方面分析藥物的作用靶點(diǎn)，以此探究藥對(duì)赤芍-牡丹皮治療中風(fēng)的作用機(jī)制[9]，揭示赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)的多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 采用及參考的數(shù)據(jù)庫(kù) 見(jiàn)表1。采用及參考的數(shù)據(jù)庫(kù)包含有TCMSP、DAVID、STRING等。

表1 采用及參考的數(shù)據(jù)庫(kù)信息

1.2 篩選藥材化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn) 充分發(fā)揮中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)的作用(TCMSP)，本文選擇了赤芍與牡丹皮來(lái)當(dāng)作主要分析對(duì)象，探究了赤芍與牡丹皮主要包括哪些化學(xué)成分。

1.3 篩選活性有效化合物 篩選條件：查閱相關(guān)中藥的活性成分，如：赤芍與牡丹皮，并對(duì)相關(guān)的目標(biāo)活性成分群進(jìn)行確定。化合物類藥性(DL)必須≥0.18，口服生物利用度(OB)必須≥30%。

1.4 中風(fēng)和活性成分的靶點(diǎn)獲取 本文主要是從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)以及Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)找到了分析中風(fēng)相關(guān)的靶點(diǎn)所需要的資料。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 采用線維恩軟件對(duì)相關(guān)的成分與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)進(jìn)行了繪制，再由STRING數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到的相關(guān)資料，成功繪制出了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)交集靶點(diǎn)，歸屬相對(duì)應(yīng)的活性成分；運(yùn)用Cytoscape 3.7.0分別繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖和疾病-藥材-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因功能富集分析與生物過(guò)程分析 借助DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)探討了中藥赤芍以及牡丹皮的核心作用靶點(diǎn)，對(duì)現(xiàn)階段關(guān)注度比較高的GO功能與KEGG 通路富集做了相關(guān)研究。

2 結(jié) 果

2.1 篩選藥材化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，收集赤芍、牡丹皮中ADME性質(zhì)符合要求化合物共計(jì)40種化學(xué)成分，其中來(lái)自赤芍的有29種，來(lái)自丹皮的有11種，上述化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)共174個(gè)。

去重復(fù)后，通過(guò)四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP、Drug Bank、TTD、Genecards)得到總計(jì)167個(gè)作用靶點(diǎn)都與中風(fēng)相關(guān)，再在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將這些靶點(diǎn)信息傳輸進(jìn)來(lái)即可轉(zhuǎn)化為Official Gene Symbol(圖1)。

圖1 赤芍-牡丹皮藥對(duì)活性成分-靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

基于PPI圖歸屬的活性成分共有17種，見(jiàn)表2。其中豆甾醇和兒茶素是赤芍和牡丹皮共有成分。

表2 赤芍-牡丹皮的化合物信息

網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)分析顯示，網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)學(xué)參數(shù)BC、CC、Degree同時(shí)滿足大于均值成分作為活性成分，分別為槲皮素、山奈酚、黃芩苷、鞣花酸4個(gè)成分(圖2)。

圖2 赤芍-牡丹皮藥對(duì)疾病-藥材-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在這個(gè)環(huán)節(jié)，需要把交集靶點(diǎn)還有其所屬通路映射關(guān)系傳輸?shù)紺ytoscape 3.7.0中去，此時(shí)就可以得出潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)(圖3)。對(duì)圖3進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)分析可知，網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)學(xué)參數(shù)BC、CC、Degree同時(shí)滿足大于均值靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，22個(gè)核心靶點(diǎn)分別為：AKT1、MAPK1、MAPK8、JUN、TNF、IL6、FOS、TP53、TGFB1、CCND1、IL1B、EGFR、CASP3、BCL2、GSK3B、BAX、VEGFA、CXCL8、CASP8、STAT1、MYC、MMP9。

圖3 赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.2 KEGG與GO分析 在閾值為P< 0.05的條件下，通過(guò) DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有效活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析與GO功能注釋，得到了排名在前幾位的生物過(guò)程與通路繪圖(圖4、5)。

圖4 赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)潛在靶點(diǎn)GO功能注釋

圖5 赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)潛在靶點(diǎn)KEGG分析

以上圖中可以看出，BP主要集中在活性氧代謝過(guò)程、有毒物質(zhì)及脂多糖等相關(guān)反應(yīng)中，并且還可以觀察到：MF集中蛋白異源二聚體活性、核受體活性、細(xì)胞因子受體進(jìn)行結(jié)合，CC功能集中膜微區(qū)與囊腔功能，初步推斷藥對(duì)赤芍-牡丹皮主要通過(guò)以上途徑治療中風(fēng)。在對(duì)赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)潛在靶點(diǎn)KEGG通路分析后，按照每條通路上富集靶點(diǎn)數(shù)量排名前10位的通路有VERF通路、Toll樣受體通路、TNF通路、IL-17信號(hào)通路、P13K-Akt通路等。

3 討 論

中風(fēng)的病理過(guò)程比較難以理解，其主要表現(xiàn)為突然昏厥、患者大部分都會(huì)出現(xiàn)身體正常功能嚴(yán)重受損的后遺癥，即平常所說(shuō)的半身不遂、言語(yǔ)不清。赤芍、牡丹皮均為毛茛科植物,兩者化學(xué)成分類似，均為清熱涼血藥，臨床常相須為用，協(xié)同增效,為活血化瘀常用藥對(duì)[10-11]。而本文所研究的赤芍，其化學(xué)成分包括赤芍苷、有機(jī)酸、黃酮類、糖類及揮發(fā)油等，具備了多種藥理效果，比如說(shuō)抗凝、有效減小血液黏稠度、使得人體微循環(huán)更加順利；并且還能夠舒通血管[12]，牡丹皮的化學(xué)成分包括了酚及苷類成分、單萜及其苷類成分、三萜類成分、香豆素類成分等多種，具備了多種藥理效果，比如說(shuō)疏通血管、可以有效降糖、促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮，并且還可以抑菌抗炎[13]。

赤芍-牡丹皮藥對(duì)能夠促進(jìn)中風(fēng)患者的恢復(fù)[14]，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法基礎(chǔ)上，對(duì)赤芍-牡丹皮藥預(yù)防中風(fēng)的效果以及原理作了相關(guān)研究。在目前得到的重點(diǎn)靶點(diǎn)中，靶點(diǎn)TNF、IL-6、IL-10是常見(jiàn)的炎癥氧化應(yīng)激等通路靶點(diǎn)，在中風(fēng)的病理過(guò)程中多有報(bào)道[15-17]；KEGG分析得到的通路如TNF 是凋亡相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路。藥對(duì)中含有β-谷甾醇，可通過(guò)抑制 TNF 相關(guān)信號(hào)通路，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，可以作用于炎癥的多個(gè)環(huán)節(jié)[18]。IL-17 屬于人體的其中一種細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性比較有代表性，能參與人體大多數(shù)的炎性反應(yīng)過(guò)程[19]，研究結(jié)果表明，中風(fēng)患者發(fā)生病變的周圍組織中 IL-17 表達(dá)過(guò)高且活性強(qiáng)度增加，因此炎性反應(yīng)加重，并誘發(fā)細(xì)胞出現(xiàn)損傷，使得病情加劇惡化[20]。與氧化作用有關(guān)的HIF1 通路中釋放的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α，是一種在缺氧的微環(huán)境下能使機(jī)體細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用的因子。使機(jī)體細(xì)胞在缺氧的環(huán)境下能提高活性，主要通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的方式，使機(jī)體細(xì)胞在缺氧的環(huán)境中適應(yīng)低氧狀態(tài)。研究結(jié)果指出，中風(fēng)患者避免不了腦水腫區(qū)域的產(chǎn)生，該區(qū)域會(huì)讓其附近組織呈現(xiàn)低氧，導(dǎo)致血清中 HIF-1α 的水平大幅度上升。

初步分析發(fā)現(xiàn)在赤芍-牡丹皮藥對(duì)化學(xué)成分與中風(fēng)最為密切相關(guān)的為槲皮素、山奈酚、黃芩苷、鞣花酸4個(gè)化學(xué)成分。其中鞣花酸和黃芩苷是赤芍的活性成分，槲皮素、山奈酚為牡丹皮的活性成分，鞣花酸雖然沒(méi)有在赤芍/牡丹皮中作為主要活性成分，但從分析結(jié)果看，鞣花酸也可能是治療中風(fēng)的潛在強(qiáng)活性成分。當(dāng)前赤芍的質(zhì)量控制成分為芍藥苷，牡丹皮的質(zhì)控成分為丹皮酚，只是可能基于研究熱度等原因未能排列在最前面，但在本文的分析中上述兩種成分也屬于核心藥效成分。在此基礎(chǔ)上，研究結(jié)果能夠指導(dǎo)赤芍-牡丹皮物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法基礎(chǔ)上，詳細(xì)探討了赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療中風(fēng)患者的原理以及可以起到的效果，發(fā)現(xiàn)赤芍-牡丹皮藥對(duì)可能是通過(guò)VERF通路、Toll樣受體通路、TNF通路、IL-17信號(hào)通路、P13K-Akt等通路協(xié)同作用發(fā)揮治療/緩解中風(fēng)功效，上述預(yù)測(cè)結(jié)果可為赤芍-牡丹皮藥對(duì)在中風(fēng)治療的藥理作用研究及臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，但還需要先一步的實(shí)驗(yàn)研究。