D-生物素合成研究進(jìn)展

劉記成，房 歡，董會(huì)娜，孫玉梅，張大偉，4

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；3.中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

生物素（biotin）也可稱為維生素B7，主要存在于大自然中的動(dòng)植物體內(nèi)，是一種維持人體正常運(yùn)動(dòng)所不可或缺的維生素，也是合成維生素C的必要物質(zhì)。它是含3個(gè)不對(duì)稱碳原子的雙環(huán)化合物，共有8種同分異構(gòu)體，但只有全順式結(jié)構(gòu)的D-生物素（D-biotin）才具有生理活性[1]。D-生物素的存在形式分為游離狀態(tài)與結(jié)合狀態(tài)，而存在于腸道中結(jié)合狀態(tài)的D-生物素必須經(jīng)微生物分解成游離狀態(tài)才能被機(jī)體利用。最容易被吸收利用的D-生物素存在于動(dòng)物的小腸中，吸收之后主要分布于心、肝和腎臟中。在豬食料中添加適量D-生物素時(shí)，會(huì)使豬的肝臟和心臟更有活力，但D-生物素添加過多時(shí)，超過自身需要的部分不會(huì)被吸收，而是隨著尿液或糞便排出體外[2-3]。

D-生物素最初在酵母的研究過程中被發(fā)現(xiàn)，參與酵母中的氮源代謝，因此在白蘭地中添加少量D-生物素可以提高酒的風(fēng)味[4]，隨著對(duì)其深入研究，D-生物素可逐漸應(yīng)用于畜牧業(yè)、生物技術(shù)和發(fā)酵工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。據(jù)報(bào)道，D-生物素可以促進(jìn)脂肪迅速分解并轉(zhuǎn)換成人體運(yùn)動(dòng)所需的能量，這一發(fā)現(xiàn)奠定了D-生物素在減肥運(yùn)動(dòng)類保健品中的應(yīng)用。自2016年以來，國內(nèi)外市場上開始暢銷含D-生物素成分的保健品，進(jìn)而D-生物素的價(jià)格也有所上升，這非常有利于我國D-生物素生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)展[5-6]。目前全球D-生物素純品的生產(chǎn)能力達(dá)到400 t/年以上，幾乎全部集中于中國，占全球97%以上的市場份額。我國的圣達(dá)生物與新和成是全球最大的兩家供應(yīng)商，據(jù)公開資料顯示，目前圣達(dá)生物的D-生物素純品年產(chǎn)能為160 t，新和成的D-生物素純品年產(chǎn)能為120 t。近年來，只能通過化學(xué)合成法對(duì)D-生物素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，但其工藝繁雜、生產(chǎn)成本昂貴和環(huán)境污染等問題，使廣大學(xué)者開始致力于用微生物合成D-生物素的研究?；谀壳吧锓ê铣蒁-生物素還處于起步階段，該文從D-生物素的生物合成途徑、代謝調(diào)控以及生物合成策略等方面進(jìn)行綜述，以期為D-生物素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供參考。

1 D-生物素的化學(xué)合成

D-生物素的完整化學(xué)合成途徑是Sternbach在1949年提出來的，因而該途徑被命名為Sternbach路線。該路線的原料為富馬酸，經(jīng)溴代、芐胺化、環(huán)合三步反應(yīng)后合成第一個(gè)關(guān)鍵中間體環(huán)酸；再與醋酸酐反應(yīng)生成的酸酐經(jīng)還原和硫代之后，獲得第二個(gè)關(guān)鍵中間體硫酮；硫酮經(jīng)格氏反應(yīng)、氧化、酸化得含硫的鎓鹽，最后經(jīng)溴代、縮合、酸化得到終產(chǎn)物D-生物素[7]。Sternbach是D-生物素大規(guī)模生產(chǎn)的基石，之后的D-生物素工業(yè)生產(chǎn)途徑均是以此方法為基準(zhǔn)一步步改進(jìn)的。

1999年陳芬兒等[8]報(bào)道了以氯霉素副產(chǎn)物右胺作為手性輔助試劑，右胺與環(huán)酸反應(yīng)后被還原成內(nèi)酯，進(jìn)而合成D-生物素，右胺的價(jià)格在當(dāng)時(shí)十分廉價(jià)，但后來因氯霉素的副作用十分嚴(yán)重，這使得右胺越來越不易獲得。2001年CHAVAN S P等[9]報(bào)道了一條生產(chǎn)路線，其生產(chǎn)原料為L-胱氨酸，經(jīng)還原、開環(huán)、硫代、強(qiáng)堿下烯醇化后在三甲基硅基的作用下經(jīng)環(huán)化得到D-生物素骨架，最后在wittig反應(yīng)下獲得終產(chǎn)物，該路線各步反應(yīng)收率很高，但合成步驟過多，且總產(chǎn)率并沒有顯著提升。2002年SEKI M等[10]報(bào)道的生產(chǎn)路線是以L-半胱氨酸為原料，首先經(jīng)三步反應(yīng)后在芐基胺和三甲基氰硅烷作用下水解生成酰胺，酰胺經(jīng)縮合得到硫酮，進(jìn)而產(chǎn)生D-生物素，該方法簡化了合成路線，但原料不易獲得。以上報(bào)道的D-生物素合成路線，或是生產(chǎn)成本較高，或是總收率偏低，均不適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。

2002年我國新昌制藥廠在合成路線上取得重大突破，將國際的11步D-生物素合成法縮減至8步，不僅簡化了工藝流程，還在降低生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上提高了D-生物素的產(chǎn)量，建立了第一條屬于我國自己的化學(xué)合成法生產(chǎn)D-生物素路線[11]。2011年和2019年我國浙江新和成藥業(yè)分別公開兩種D-生物素合成方法，在2011年公開的方法主要解決了生產(chǎn)原料在和2,2-二氰基乙酸乙酯反應(yīng)過程中生成副產(chǎn)物的問題，提高了這一步的反應(yīng)效率，但總收率并沒有顯著提高；在2019年公開的方法是以半胱氨酸鹽酸鹽、苯甲醛和芐基異氰酸酯為起始原料，經(jīng)9步反應(yīng)生成D-生物素，該方法生產(chǎn)成本低且產(chǎn)物分離容易，是目前最適合我國工業(yè)化生產(chǎn)D-生物素的路線[12-13]。

由以上報(bào)道可知，化學(xué)法合成D-生物素的途徑已經(jīng)非常成熟，經(jīng)過廣大學(xué)者們的研究，其生產(chǎn)成本昂貴的問題基本上被解決。但化學(xué)法對(duì)環(huán)境造成污染的問題依舊無法徹底解決，另外其生產(chǎn)工藝流程依舊很復(fù)雜，因此加大利用生物法合成D-生物素的研究力度就顯得非常重要。

2 D-生物素的生物合成

2.1 D-生物素的生物合成途徑

大多數(shù)微生物都能從頭合成D-生物素，且從前體物質(zhì)庚二酸單酰載體蛋白（pimeloyl acyl carrier protein，Pim-ACP）或庚二酸單酰輔酶A到D-生物素的途徑是基本一致的。據(jù)報(bào)道，這部分反應(yīng)的大體過程為，先由7-酮基-8-氨基壬酸合成酶（BioF）催化L-丙氨酸與庚二酸單酰載體蛋白（Pim-ACP）反應(yīng)生成7-酮基-8-氨基壬酸（7-keto-8-amino-pelargonic acid，KAFA），隨后7,8-二氨基壬酸合成酶（BioA）將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethiomnine，SAM）或賴氨酸上的氨基轉(zhuǎn)移到KAPA上生成7,8-二氨基壬酸（7,8-diamino-pelargonic acid，DAPA），然后脫硫生物素合成酶（BioD）在CO2和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的參與下閉合脲基環(huán)DAPA生成脫硫生物素（dethiobiotin，DTB），最后DTB在生物素合成酶（BioB）和其他輔因子的作用下合成D-生物素（圖1）[14-15]。它們的不同之處在于早期合成前體物質(zhì)：革蘭氏陰性菌在合成前體時(shí)，以大腸桿菌為代表，丙二酸單酰ACP在BioC（與D-生物素早期合成有關(guān)）作用下ω-羧基發(fā)生甲基化生成丙二酸單酰ACP甲酯，隨后經(jīng)過兩輪脂肪酸延伸循環(huán)生成庚二酰單酰ACP甲酯，在BioH（與D-生物素早期合成有關(guān)）催化下去甲基生成庚二酸單酰ACP，最后進(jìn)行D-生物素的合成；而革蘭氏陽性菌，以枯草芽孢桿菌為代表，長鏈?；鵄CP在一種細(xì)胞色素P450酶BioI催化下生成庚二酸單酰ACP，或者庚二酸在ATP依賴的BioI酶催化下生成庚二酸單酰輔酶A，然后庚二酸單酰ACP或庚二酸單酰輔酶A作為前體生成D-生物素（圖1）[16-17]。近期，SAKAKI K等[18]研究發(fā)現(xiàn)Synechocystissp.PCC 6803在缺失了bioA基因的情況下仍然可以產(chǎn)生D-生物素，研究人員對(duì)此進(jìn)行了生物信息分析等一系列實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)了一種新型多功能脫氫酶BioU的存在，BioU除了可以代替BioA，還具有BioD的一些功能，并且在整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后會(huì)失去催化活性，這一發(fā)現(xiàn)為D-生物素的生物合成提供了一個(gè)新的思路。

圖1 D-生物素合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of D-biotin

2.2 D-生物素生物合成操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制

在動(dòng)物體內(nèi)，D-生物素通過將生物素環(huán)束縛在蛋白質(zhì)上的長鏈的幫助下，可在具有酶活的部位上接受羧基，之后釋放給底物受體，進(jìn)而可以參與體內(nèi)一系列羧化反應(yīng)。在原核生物中，生物素連接酶也叫BirA蛋白，在D-生物素生物合成操縱子的轉(zhuǎn)錄過程中進(jìn)行負(fù)調(diào)控。當(dāng)胞內(nèi)的D-生物素積累超過一定量的時(shí)候，BirA蛋白會(huì)與生物素中間體（生物素-5-單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）結(jié)合形成配體，之后再與生物素操縱子結(jié)合，最終會(huì)阻遏生物素操縱子基因的表達(dá)；當(dāng)胞內(nèi)的D-生物素積累量降低時(shí)，?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶A羧化酶的亞基（AccB受體蛋白）上，BirA蛋白不與生物素-5-AMP結(jié)合，進(jìn)而相關(guān)基因開始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的乙酰輔酶A羧化酶的另一個(gè)亞基-AccC蛋白過量時(shí)，AccB與AccC蛋白便會(huì)形成一個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)體，從而?；d體（ACP）無法與AccB蛋白結(jié)合，此時(shí)BirA蛋白又與biotinoyl-5-AMP結(jié)合成配體，導(dǎo)致其基因的表達(dá)被阻遏[19]。解決這個(gè)基因表達(dá)被阻遏的問題可成為研究者們提高微生物合成D-生物素產(chǎn)量的一種手段。

BirA蛋白在生物素-親和素的研究中也起到十分重要的作用，該研究中的BirA蛋白均來自于原核生物。生物素與親和素/鏈酶親和素有高度的親和性，可形成十分穩(wěn)定的締合體，是蛋白質(zhì)-生物小分子體系中結(jié)合自由能較強(qiáng)的體系。生物素-親和素/鏈酶親和素體系具有高度的穩(wěn)定性，在中性條件下的解離常數(shù)為10～15 mol/L，遠(yuǎn)高于其他的配體-受體作用。兩個(gè)體系可以偶聯(lián)蛋白質(zhì)、核酸和酶等活性物質(zhì)，還能結(jié)合固體材料，并且一個(gè)蛋白質(zhì)分子上可以結(jié)合多個(gè)生物素分子，同時(shí)一個(gè)親和素也可以結(jié)合4個(gè)生物素分子，因此生物素-親和素體系還可起到多級(jí)放大的作用。生物素-親和素/鏈酶親和素體系的這些作用，使得其在診斷分析和蛋白質(zhì)工程等方面得到廣泛應(yīng)用[20]。

2.3 微生物合成D-生物素的研究進(jìn)展

大多數(shù)的微生物都可以用來生產(chǎn)D-生物素，但其原始菌株的生產(chǎn)能力都不高，因此需要根據(jù)代謝工程理論，對(duì)D-生物素生產(chǎn)菌株通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段來提高產(chǎn)量。研究者們主要通過對(duì)D-生物素生產(chǎn)菌株進(jìn)行抗性篩選、導(dǎo)入人工改進(jìn)的生物素操縱子、提高某些輔助因子含量、增強(qiáng)有用的基因以及敲除不利基因等手段來提高微生物合成D-生物素的產(chǎn)量。目前研究的最新成果見表1。

表1 通過代謝控制及基因工程方法構(gòu)建D-生物素高產(chǎn)菌的研究進(jìn)展Table 1 Research progress of high yield D-biotin microbes constructed by metabolic control and genetic engineering

2.3.1 代謝控制育種

提高D-生物素產(chǎn)量的首要條件就是篩選優(yōu)良的微生物菌種，由D-生物素生物合成途徑可知，SAM參與了其中的多個(gè)反應(yīng)，因此通過代謝途徑控制提高發(fā)酵過程中SAM的供應(yīng)量，是獲得高產(chǎn)D-生物素菌株的較好的方法。KANZAKI N等[21]對(duì)大腸菌株進(jìn)行β-羥基正纈氨酸抗性篩選，得到了一株突變體E.coliANA91/pXBRP319，其原理是通過提高細(xì)胞體內(nèi)的甲硫氨酸水平從而增加氨基酸供體的數(shù)量，最終增強(qiáng)了工程菌株產(chǎn)D-生物素的能力，其生產(chǎn)能力達(dá)970 mg/L，這是目前國內(nèi)外用大腸桿菌產(chǎn)D-生物素的最高產(chǎn)量。林建平等[22]通過B.subtilis168中bioW基因序列和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZJU001中S-腺苷-甲硫氨酸合成酶基因（sam2）序列來促進(jìn)兩段生物素操縱子基因bioBFHCD和bioA對(duì)生物素的合成，用E.coliBL21（DE3）為產(chǎn)生菌在以庚二酸為底物的培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，D-生物素產(chǎn)量提高了200倍，達(dá)到417 mg/L，這是現(xiàn)階段我國用大腸桿菌產(chǎn)D-生物素的最高產(chǎn)量。達(dá)雄星野等[23]對(duì)庫特氏菌538-6的酸霉素、5-（2-噻吩基）-戊酸和脫硫生物素抗性進(jìn)行篩選，得到庫特氏菌屬538-2A13，用FM1培養(yǎng)基發(fā)酵，將D-生物素產(chǎn)量由0提高到126 mg/L。SAKURAI N等[24]對(duì)粘質(zhì)沙雷菌進(jìn)行放線噻唑酸抗性進(jìn)行篩選，得到了菌株S.marcescensSB412，之后使菌株突變對(duì)乙硫氨酸和S-2-氨基乙基半胱氨酸產(chǎn)生抗性，從而獲得菌株ETA 23，再以攜帶parB位點(diǎn)的pLGM304P作為載體來過表達(dá)全部bio基因，最后對(duì)其進(jìn)行高密度培養(yǎng)，D-生物素最高可積累到500 mg/L。金學(xué)明等[25]從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買一株擲孢酵母，經(jīng)誘變獲得S.cesrosellsHK301，之后在發(fā)酵過程中對(duì)其進(jìn)行碳源、氮源以及金屬離子優(yōu)化，最終D-生物素產(chǎn)量提高一倍，達(dá)到540 mg/L。

2.3.2 基因工程育種

基因工程育種可通過在D-生物素代謝途徑中敲除某些對(duì)產(chǎn)物有抑制作用的基因或加強(qiáng)有用基因的表達(dá)來提高D-生物素的表達(dá)量，這是現(xiàn)階段最有發(fā)展的一種育種方法。GLOECKLER R等[26]從B.sphaericusIFO3525菌株中擴(kuò)增出生物素操縱子bioXWF基因，構(gòu)建出PTG3405質(zhì)粒，并用trp為載體轉(zhuǎn)化到E.coliC258中，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，D-生物素產(chǎn)量可達(dá)150 mg/L。BOWE R等[27]用高生物素和α-脫氫生物素來篩選枯草芽孢桿菌生物素類似物抗性的突變菌株，其原理是bioA基因位點(diǎn)的某個(gè)氨基酸序列發(fā)生突變，之后將篩選成功菌株的所有bio基因進(jìn)行過表達(dá)，得到菌株B.subtilisBI282，最終以SAM為氨基酸供體用VY培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵，維生素總產(chǎn)量達(dá)到了600 mg/L，但其中D-生物素產(chǎn)量卻只有6 mg/L。之后VAN ARSDELL S W等[28]對(duì)B.subtilisBI282進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸比SAM更適合作為枯草芽孢桿菌的氨基酸供體，用L-賴氨酸作氨基酸供體進(jìn)行發(fā)酵的D-生物素產(chǎn)量可達(dá)21 mg/L，盡管如此，其D-生物素產(chǎn)量依舊不高。由此可知，對(duì)于枯草芽孢桿菌來說，合成D-生物素的最后一步仍然是個(gè)瓶頸。SHAW N M等[29]將經(jīng)修飾的大腸桿菌中的生物素操縱子bioBFCDA連接到pB047上，將構(gòu)建出質(zhì)粒Pbo30A-15/9轉(zhuǎn)化到Agrobacterium/RhizobiumHK4中，上罐發(fā)酵最高可產(chǎn)生110 mg/LD-生物素。XIAO F等[30]對(duì)異變假單胞菌進(jìn)行了過表達(dá)合成途徑中的限速酶編碼基因，敲除負(fù)調(diào)控因子，增強(qiáng)輔因子的供應(yīng)以及引入枯草芽孢桿菌的BioW-BioI途徑這四級(jí)代謝工程改造，之后以甘油為碳源將改造好的菌株進(jìn)行發(fā)酵，D-生物素最高產(chǎn)量為272 mg/L，這也是目前除粘質(zhì)沙雷菌和大腸桿菌外產(chǎn)量最高的D-生物素生產(chǎn)菌株。

由以上報(bào)道可知，近年來微生物合成D-生物素的發(fā)展十分迅速，但盡管如此，生物法依舊無法與化學(xué)法競爭。主要原因還是產(chǎn)量達(dá)不到工業(yè)化的要求，其中D-生物素生物合成途徑的脫硫生物素到D-生物素是限速步驟，這一過程是由BioB催化的，BioB是一個(gè)催化速度很慢的酶（Kcat=0.12 min-1），而過度表達(dá)bioB基因還會(huì)抑制生物素的轉(zhuǎn)化[31]。這一步反應(yīng)依賴氨基酸供體，研究表明，枯草芽孢桿菌的氨基酸供體為L-賴氨酸，其他D-生物素產(chǎn)生菌為SAM。氫鍵可連接BioB保守模體上的天冬酰胺殘基（Asn153）和天冬氨酸殘基（Asp155）與氨基酸供體和脫硫生物素，并與結(jié)合在BioB上的[4Fe-4S]2+和[2Fe-2S]2+形成一個(gè)類似三角體的結(jié)構(gòu)，其中[4Fe-4S]2+可促進(jìn)氨基酸供體還原性裂解，而[2Fe-2S]2+可為脫硫生物素形成D-生物素提供硫原子，因此對(duì)Fe-S簇的研究是提高BioB 酶活的關(guān)鍵[32-33]。同時(shí)在構(gòu)建D-生物素高產(chǎn)菌株的過程中，重組載體質(zhì)粒構(gòu)建的穩(wěn)定性也是D-生物素生物合成的一個(gè)瓶頸，過表達(dá)參合其生物合成的關(guān)鍵基因卻導(dǎo)致生物素產(chǎn)物生成受抑制的機(jī)理也要深入研究，此外注意帶有毒性的副產(chǎn)物生成也是重中之重。

3 展望

目前，研究者們正在利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段來攻克D-生物素生物合成中的瓶頸，尤其是近年來生物信息學(xué)以及蛋白質(zhì)工程的發(fā)展十分迅速，可以通過各種計(jì)算機(jī)軟件對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行深入分析以及計(jì)算輔助提高酶的活性[34]，如對(duì)bioB基因進(jìn)行深入分析，并以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為支撐，可以通過對(duì)bioB基因堿基序列的改變來減少密碼子的使用頻率，再利用量子化學(xué)計(jì)算等操作提高BioB酶的酶活，進(jìn)而解決脫硫生物素轉(zhuǎn)化為D-生物素效率低這一瓶頸。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，相信很快可以得到D-生物素高產(chǎn)菌株，以生物法完全代替化學(xué)合成，實(shí)現(xiàn)D-生物素的綠色生產(chǎn)。