李金鑫，劉 輝，谷 巍*，王桐霖，孟凡進(jìn)

（1.山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000；2.壽光市文家街道畜牧獸醫(yī)工作站，山東濰坊 262700）

近年來，我國(guó)草食畜牧業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)良好勢(shì)頭，但是生產(chǎn)總量和生產(chǎn)方式仍然明顯滯后于畜牧業(yè)整體發(fā)展水平，尤其是飼草料供需缺口巨大，嚴(yán)重阻礙了草食畜牧業(yè)乃至整個(gè)現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的步伐。進(jìn)而隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，粗飼料短缺問題日漸突出，阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，充分合理地利用秸稈飼料是緩解環(huán)境污染和粗飼料短缺的有效途徑。

農(nóng)作物秸稈在自然條件下是一種劣質(zhì)飼料，其特點(diǎn)是蛋白質(zhì)含量低而且品質(zhì)不佳；粗纖維含量高，其中不易被家畜消化的木質(zhì)素含量較高，質(zhì)地粗硬，適口性差，采食率極低[1]。因此，將玉米秸稈調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性使其過腹轉(zhuǎn)化增值，對(duì)促進(jìn)玉米秸稈飼料化利用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，農(nóng)作物秸稈的綜合利用是當(dāng)前保護(hù)生態(tài)環(huán)境與節(jié)約再生能源的迫切需要，是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求[2]。

目前，我國(guó)通過青貯技術(shù)處理秸稈，在一般情況下，玉米秸稈上附著的乳酸菌數(shù)量不足，自身營(yíng)養(yǎng)成分有限，青貯早期有益菌繁殖緩慢，而有害微生物繁殖較快，導(dǎo)致難以獲得品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料[3]。為獲得更好的青貯飼料，劉子瑜[4]在青貯中添加異型乳酸菌中的布氏乳桿菌以提高青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性；張適等[5]研究了不同乳酸菌對(duì)全株玉米發(fā)酵品質(zhì)影響，認(rèn)為乳酸菌能有效降低粗蛋白損失，降低氨氮/總氮含量，顯著提高青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量；經(jīng)爭(zhēng)輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合菌可以改善玉米秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，延長(zhǎng)青貯玉米秸稈有氧暴露后的保存時(shí)間。市場(chǎng)上的青貯添加劑主要可分為同型乳酸菌類、異型乳酸菌類、同型乳酸菌和異型乳酸菌復(fù)合劑類，因此在青貯過程中添加青貯劑提高青貯飼料品質(zhì)逐漸被養(yǎng)殖行業(yè)所接受。添加乳酸菌雖然提高青貯飼料品質(zhì)，但對(duì)二次發(fā)酵的改善效果卻不顯著。為解決二次發(fā)酵問題，在青貯玉米秸稈上嘗試復(fù)合菌劑與酸化劑配合使用，以期在保證青貯飼料品質(zhì)的同時(shí)，提高青貯有氧穩(wěn)定性，同時(shí)監(jiān)測(cè)青貯飼料發(fā)酵過程中酵母菌、乳酸菌變化規(guī)律及發(fā)酵后產(chǎn)物，為今后青貯飼料制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌劑及酸化劑

布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosus）：山東寶來利來生物工程股份有限公司。

酸化劑制備：將己酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈉溶于水中制成復(fù)合酸化劑，使其每升含有11 g己酸，257 g苯甲酸鈉，134 g山梨酸鉀和57 g丙酸銨。

1.1.2 青貯制備

玉米籽粒2/3乳線期收割秸稈，切至2～3 cm每段，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將菌液、酸化劑均勻地噴灑在青貯原料上，填裝壓實(shí)并確保聚乙烯青貯袋邊角充分壓實(shí)，抽真空后再用收縮膜密封，25 ℃厭氧發(fā)酵3個(gè)月，得到青貯飼料。

1.1.3 試劑

己酸（分析純）：默克Sigma-Aldrich公司；苯甲酸鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；山梨酸鉀（分析純）：濟(jì)南青?；び邢薰荆槐徜@（分析純）：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-103F自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；TRACETM1300氣相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PB-10酸度計(jì)：德國(guó)Sartorious公司；Optima Wax色譜柱（0.25 mm×0.25 μm×30 m）：德國(guó)杜倫Macherey-Nagel公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（CK，無添加）、布氏乳桿菌試驗(yàn)組（L1，菌添加量105CFU/g青貯原料）、植物乳桿菌試驗(yàn)組（L2，菌添加量105CFU/g青貯原料）、戊糖片球菌菌試驗(yàn)組（L3，菌添加量105CFU/g青貯原料）、復(fù)合菌劑試驗(yàn)組（L4布氏乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌等比例添加，總添加量105CFU/g青貯原料）、復(fù)合菌劑+酸化劑試驗(yàn)組（L5在復(fù)合菌劑試驗(yàn)組基礎(chǔ)上額外添加復(fù)合酸化劑10 mL/kg），每個(gè)聚乙烯青貯袋里填充4 kg玉米秸稈青貯飼料，每個(gè)處理設(shè)8個(gè)重復(fù)，抽真空后密封，在25 ℃條件下進(jìn)行青貯，分別在15 d、30 d、45 d、60 d、90 d取樣（在取樣時(shí)間點(diǎn)取樣后棄用以防污染）測(cè)定pH、乳酸菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)。青貯90 d完成后，開袋測(cè)定粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等指標(biāo)，并在有氧條件下暴露，每12 h分別取樣分析有氧穩(wěn)定性。

1.3.2 干物質(zhì)量測(cè)定[7]

取100 g青貯鮮樣，置于65 ℃的烘箱中烘至質(zhì)量恒定，冷卻后稱質(zhì)量，干物質(zhì)含量計(jì)算公式如下：

1.3.3 pH值測(cè)定

根據(jù)青貯飼料理化品質(zhì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[8]用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定

采用凱氏定氮法進(jìn)行粗蛋白的測(cè)定；利用范氏法測(cè)定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量[9]，乳酸乙酯和乙酸乙酯采用氣相色譜測(cè)定[10]。

青貯中有機(jī)酸的測(cè)定[11]：稱取5 g待測(cè)試樣品置于離心管中，加入30 mL超純水并加入H2SO4酸化使pH＜2，蓋緊蓋子，于4 ℃浸提24 h，然后用氣相色譜法[12]測(cè)定乳酸、乙酸含量。

1.3.5 活菌數(shù)的測(cè)定

取10 g青貯飼料樣品加入含有90 mL無菌水的三角瓶中，放入220 r/min搖床30 min，利用平板計(jì)數(shù)方法測(cè)定乳酸菌、酵母菌活菌數(shù)。

1.3.6 有氧穩(wěn)定性測(cè)定[13]

青貯飼料有氧穩(wěn)定性：每個(gè)重復(fù)中取出500 g樣品放入聚乙烯塑料袋，用牙簽扎出孔隙，放置于恒溫隔熱的塑料泡沫箱內(nèi)，將溫度記錄儀插入青貯樣品中心，每30 min記錄一次。青貯有氧穩(wěn)定性為青貯飼料中心溫度比室溫高2 ℃所需要的時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯過程中乳酸菌含量動(dòng)態(tài)變化

青貯原料乳酸菌菌數(shù)為1.86×105CFU/g，不同時(shí)間及不同處理?xiàng)l件下乳酸菌含量的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見圖1。由圖1可知，與CK相比，在青貯中添加乳酸菌菌劑（L1、L2、L3、L4、L5試驗(yàn)組）可以使青貯初期乳酸菌含量迅速增加，15 d以后各組乳酸菌含量變化趨于平緩，45 d以后L1、L2、L3、L4、L5試驗(yàn)組乳酸菌菌數(shù)明顯高于CK。30 d和90 d時(shí)，復(fù)合菌劑試驗(yàn)組（L4）乳酸菌菌數(shù)顯著高于CK組、布氏乳桿菌試驗(yàn)組（L1）、植物乳桿菌試驗(yàn)組（L2）、戊糖片球菌試驗(yàn)組（L3）（P＜0.05），與復(fù)合菌劑＋酸化劑試驗(yàn)組（L5）差異不顯著（P＞0.05），可見相比較于添加單一菌株，添加復(fù)合菌株更有利于青貯玉米秸稈中乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)酸化劑的添加也未起到消極作用。這可能是由于不同乳酸菌具有不同的功能，當(dāng)不同類型乳酸菌復(fù)配在一起時(shí)，其協(xié)同作用更有利于形成適宜乳酸菌生存環(huán)境。

圖1 玉米秸稈青貯過程中乳酸菌數(shù)變化Fig.1 Change of lactic acid bacteria number during corn straw silage

2.2 青貯過程中酵母菌含量

青貯原料酵母菌菌數(shù)為6.46×106CFU/g。不同時(shí)間及不同處理?xiàng)l件下酵母菌含量變化結(jié)果見圖2。

圖2 玉米秸稈青貯過程中酵母菌數(shù)變化Fig.2 Change of yeast number during corn straw silage

由圖2可知，添加乳酸菌試驗(yàn)組酵母菌含量均顯著低于CK處理（P＜0.05）；90 d時(shí)，各處理酵母菌數(shù)為L(zhǎng)5＜L4＜L1＜L2＜L3，且30 d后L5處理酵母菌數(shù)量顯著小于其他處理（P＜0.05），充分說明在青貯中添加復(fù)合菌劑及酸化劑可以更好抑制酵母生長(zhǎng)繁殖，酸化劑也明顯促進(jìn)對(duì)酵母菌的抑制作用。

2.3 青貯過程中pH值動(dòng)態(tài)變化

圖3 玉米秸稈青貯過程中pH值變化Fig.3 Change of pH value during corn straw silage

由圖3可知，隨著青貯過程的進(jìn)行，各處理pH不斷降低，特別是L5處理由于酸化劑的添加，初始pH就低于其他處理，而且在0～90 d青貯過程中，L5處理的pH大體上小于其他處理；雖然各處理pH均處于下降趨勢(shì)，但各處理仍未能很好的抑制酵母菌。

2.4 青貯90 d發(fā)酵產(chǎn)物

青貯原料干物質(zhì)含量為35.25%，為進(jìn)一步評(píng)定干物質(zhì)損失，測(cè)定了90d時(shí)各處理青貯玉米秸稈干物質(zhì)量，結(jié)果見表1。由表1可知，通過計(jì)算可得，發(fā)酵90 d時(shí)CK、L1、L2、L3、L4、L5處理干物質(zhì)損失率分別為12.76%、7.57%、10.29%、11.25%、3.37%、5.19%，添加復(fù)合菌劑降低干物質(zhì)損失效果最為顯著（P＜0.05）。添加復(fù)合菌劑更能促進(jìn)青貯前期乳酸發(fā)酵，加速青貯內(nèi)環(huán)境的酸化，進(jìn)而抑制有害微生物的活性，從而減少干物質(zhì)損失。

表1 青貯玉米秸稈發(fā)酵90 d化學(xué)成分分析結(jié)果Table 1 Results of chemical composition analysis of silage corn straw after fermentation 90 d

青貯玉米秸稈發(fā)酵90 d時(shí)L1、L2、L3、L4、L5處理組粗蛋白、乳酸、乙酸含量較CK均有顯著提高（P＜0.05），但酸性洗滌纖維差異不大（P＞0.05）；與CK相比，L1、L2、L3、L4、L5處理明顯降低了中性洗滌纖維、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量（P＜0.05）。與單一菌劑相比，添加復(fù)合菌劑明顯降低中性洗滌纖維含量（P＜0.05），說明不同乳酸菌之間的協(xié)同作用增強(qiáng)了對(duì)纖維素的降解能力；另外，添加復(fù)合菌劑及酸化劑試驗(yàn)組（L5）比添加單一菌株試驗(yàn)組（L1、L2、L3）粗蛋白含量均有顯著提升（P＜0.05），僅添加復(fù)合菌劑處理（L4）與L1、L2處理差異不顯著（P＞0.05），說明酸化劑的添加對(duì)減少青貯蛋白損失起到積極作用，但L5處理的粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、乳酸指標(biāo)與L4處理無顯著差異（P＞0.05），說明了酸化劑對(duì)青貯的粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、乳酸含量影響不大。與CK相比，L2、L4、L5處理乳酸乙酯、乙酸乙酯含量顯著降低（P＜0.05），L1處理僅降低了乳酸乙酯含量；L5處理乳酸乙酯、乙酸乙酯含量明顯低于L4處理，說明添加酸化劑大大限制了乳酸乙酯、乙酸乙酯在青貯中的積累。

2.4 青貯飼料有氧穩(wěn)定性

不同處理有氧穩(wěn)定性結(jié)果如圖4所示，有氧暴露后青貯pH變化如圖5所示。由圖4可知，添加菌劑處理的有氧穩(wěn)定性均高于CK處理，其中L5處理有氧穩(wěn)定性最強(qiáng)，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），L4處理與L1、L2處理之間差異不大（P＞0.05），說明與單一菌劑相比，復(fù)合菌劑對(duì)提升青貯有氧穩(wěn)定性效果不明顯（P＞0.05），但添加酸化劑后提升效果顯著（P＜0.05）。由圖5可知，在青貯與空氣接觸后，0～3 d時(shí)各處理pH變化趨于平緩，3 d后pH開始快速上升，其中L5處理在0～11 d過程中pH均處于最低水平，在到達(dá)11 d時(shí)pH顯著低于其他處理（P＜0.05），添加酸化劑可將有氧暴露0～11 d內(nèi)青貯的pH保持在5以下，有助于抑制酵母菌、霉菌等腐敗菌生長(zhǎng)繁殖。

圖4 各處理組青貯飼料有氧穩(wěn)定性結(jié)果Fig.4 Results of aerobic stability of silage of each treatments group

圖5 有氧暴露后青貯飼料pH值變化Fig.5 pH change of silage after aerobic exposure

3 討論

青貯發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過程。同型乳酸菌代謝產(chǎn)物主要為乳酸，能迅速降低青貯飼料的pH，但其發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸較少不能對(duì)青貯中的腐敗菌產(chǎn)生良好的抑制效果[14-15]。異型乳酸菌雖然消耗底物更多，但可以產(chǎn)生大量乙酸抑制真菌生長(zhǎng)繁殖，從而提高青貯有氧穩(wěn)定性，減少二次發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)損失。鑒于此，復(fù)合菌劑為我國(guó)青貯生物添加劑研究提供新思路。萬江春等[16]研究發(fā)現(xiàn)，添加同型/異型乳酸菌與單一菌種相比，雖然對(duì)發(fā)酵品質(zhì)影響不大，但顯著增加了乳酸、乙酸含量，有效抑制酵母菌的種類和數(shù)量。苗芳等[17]采用隸屬函數(shù)法綜合各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異型乳酸菌菌劑布氏乳桿菌處理優(yōu)于復(fù)合同、異型乳酸菌處理。ARRIOLA K G等[18]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加布氏乳桿菌比添加戊糖片球菌和布氏乳桿菌更能提高玉米青貯品質(zhì)。李曉玲等[19]研究表明，在青貯中添加單一和復(fù)合乳酸菌添加劑的作用效果尚無明確判定，且不同乳酸菌種類及復(fù)配比例下的復(fù)合乳酸菌添加劑作用與效果也不同。本研究中，在青貯中添加植物乳桿菌、布氏乳桿菌、戊糖片球菌3種菌株的復(fù)合菌劑與添加單一菌劑布氏乳桿菌或植物乳桿菌相比，干物質(zhì)量、粗蛋白、乳酸、乳酸乙酯、有氧穩(wěn)定性等指標(biāo)差異不明顯，說明與單一菌劑相比，在青貯中添加復(fù)合菌劑在青貯發(fā)酵品質(zhì)上未表現(xiàn)出突出優(yōu)勢(shì)?？梢姡煌l(fā)酵類型的乳酸菌按不同的方式混合添加，其協(xié)同作用各不相同[20-21]，但菌株之間是如何協(xié)同作用還需要更多研究證實(shí)。雖然在本研究中復(fù)合菌劑與布氏乳桿菌、植物乳桿菌之間差異未達(dá)顯著水平，但復(fù)合菌劑與酸化劑配合使用顯著提高青貯粗蛋白含量，有效提高青貯有氧穩(wěn)定性。

國(guó)外有研究表示，青貯飼料中揮發(fā)性有機(jī)物不僅可能會(huì)產(chǎn)生異味，有造成空氣污染的風(fēng)險(xiǎn)[22]，還不利于反芻動(dòng)物的采食量及新陳代謝[23]。在青貯中添加復(fù)合菌劑和酸化劑，與復(fù)合菌劑處理相比，雖然在干物質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗蛋白、乳酸指標(biāo)上無顯著差異，但顯著降低了乳酸乙酯、乙酸乙酯含量。添加酸化劑有效抑制乙酸乙酯、乳酸乙酯的積累，預(yù)防環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)，提高青貯適口性。

有氧穩(wěn)定性也是評(píng)價(jià)飼料的一個(gè)重要指標(biāo)，提高有氧穩(wěn)定性，可以防止進(jìn)一步的干物質(zhì)和能量損失。復(fù)合菌劑和酸化劑組合的處理有氧穩(wěn)定性顯著高于其他處理且顯著抑制酵母菌生長(zhǎng)，從青貯過程pH變化也可以看出復(fù)合菌劑＋酸化劑，可以更快速降低pH，在發(fā)酵15 d時(shí)就顯著低于其他處理，有氧暴露后0～11 d內(nèi)pH也是低于其他處理的，說明添加酸化劑可以有效延長(zhǎng)青貯飼料有氧暴露后的保存時(shí)間。究其原因，己酸具有兩親性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可溶解細(xì)菌細(xì)胞膜并由于對(duì)電子傳輸鏈的干擾而擾亂氧化磷酸化過程，因而具有抗菌作用[24]；苯甲酸鈉具有廣譜抗微生物作用，其殺菌、抑菌效力會(huì)隨著介質(zhì)酸度的增加而增強(qiáng)；山梨酸鉀有很強(qiáng)的抑制腐敗菌和霉菌的作用，在酸性介質(zhì)中能充分發(fā)揮防腐作用；丙酸銨在酸性條件下產(chǎn)生游離丙酸，對(duì)各類霉菌、革蘭氏陰性桿菌有較好的抑菌效果。

4 結(jié)論

無論是單獨(dú)添加布氏乳桿菌或植物乳桿菌，還是混合添加布氏乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌，均可顯著提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。添加復(fù)合菌劑＋酸化劑與單獨(dú)添加布氏乳桿菌或植物乳桿菌相比，復(fù)合菌劑＋酸化劑的添加有效抑制酵母生長(zhǎng)，顯著提高了青貯飼料有氧穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了青貯儲(chǔ)藏時(shí)間，而且酸化劑的添加不僅未對(duì)青貯飼料品質(zhì)產(chǎn)生消極影響，還明顯提高青貯飼料中粗蛋白含量。綜合考慮發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性，復(fù)合菌劑＋酸化劑具有推廣利用的潛質(zhì)，在生產(chǎn)實(shí)踐上可深入研究。