周 彬，李清安，孫代華，張雪元，曹 菁，宋娟娟，褚飛洋

（1. 勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000；2. 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435100）

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴的干燥成熟種子，俗稱香豆子、香草子，具有溫腎、祛寒、止痛作用，主要用于腎臟虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等疾病，為藥食兼用植物，國內(nèi)外一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物試驗(yàn)中胡蘆巴具有降血糖的作用[1-2]，能夠降低糖尿病大鼠血糖，引起了人們的關(guān)注，研究表明，胡蘆巴降血糖主要功效成分有總皂苷[3-4]、多糖[5]、胡蘆巴堿[6-8]、4 - 羥基異亮氨酸[9-10]等，以總皂苷為目標(biāo)成分進(jìn)行提取工藝研究，為胡蘆巴在血糖控制方面的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 試劑材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

胡蘆巴藥材，湖北正光九資河藥業(yè)提供；PT 固相萃取柱，河北津楊提供；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品（97.4%），食品藥品檢定研究院提供；甲醇、冰醋酸、5%香草醛冰乙酸（香草醛5 g 加冰乙酸溶解并定容至100 mL）、高氯酸（均為分析純），國藥提供；純凈水等。

1.2 儀器

小型粉碎機(jī)，上海頂帥產(chǎn)品；TU1901 型紫外分光光度計(jì)，北京譜析產(chǎn)品；EYEL4 N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾朗產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，常州國宇產(chǎn)品；AB135-S 型電子天平，梅特勒產(chǎn)品；調(diào)速玻璃反應(yīng)釜，長城科工貿(mào)產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總皂苷檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 樣品總皂苷檢測方法

參照衛(wèi)生部2003 版《保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評價(jià)規(guī)范》中制定的總皂苷檢測方法，藥材粉碎過60 目篩，提取物樣品粉碎過100 目篩，取1 g 藥材粉末或適量提取物置于100 mL 三角瓶中，加50 mL 純水超聲提取30 min，冷卻后以純水恢復(fù)原質(zhì)量，濾紙過濾，取濾液1 mL 上樣已預(yù)處理的總皂苷檢測專用PT 固相萃取柱（預(yù)處理方法：70%乙醇洗脫25 mL，再以純水洗脫25 mL），先以25 mL 純水洗脫，再以25 mL 70%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，于蒸發(fā)皿中60 ℃蒸干，加0.4 mL 的5%香草醛冰乙酸溶解蒸發(fā)皿中的殘?jiān)⒃偌?.6 mL 高氯酸顯色，混勻后轉(zhuǎn)移至10 mL 比色管，塞上管塞，于60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷卻并加入10 mL 的冰乙酸，充分混勻，于波長560 nm 處測定吸光度得總皂苷濃度。2.1.2 總皂苷檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱得純度97.4%的人參皂苷Re 對照品15.67 mg 于10 mL 容量瓶，凈含量為15.26 mg，甲醇溶解并定容至刻度，即質(zhì)量濃度為1.526 mg/mL，分別取40，80，120，160，200，240 μL于10 mL比色管配制成質(zhì)量濃度5.086 7，10.173 3，15.259 9，20.346 5， 25.433 1，30.519 7 mg/L 的人參總皂苷溶液，于60 ℃水浴蒸干，分別加入0.4 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛冰乙酸溶解殘?jiān)⒃偌?.6 mL 高氯酸顯色，塞緊管塞，60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷卻并加入10 mL 的冰乙酸，混勻，于波長560 nm 處測定吸光度。以總皂苷含量C 為橫坐標(biāo)，以吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：A=0.025 94C-0.051 93，即C=（A + 0.051 93）÷0.025 94，R2=0.999 92，在5.086 7～30.519 7 mg/L 范圍內(nèi)線性良好。

總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 藥材總皂苷檢測

取胡蘆巴藥材適量，萬能粉碎機(jī)粉碎，過篩，取過篩粉末1 g 置100 mL 容量瓶中，加100 mL 純水超聲提取30 min，再以水定容至刻度，按2.1.1 中方法檢測皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測得藥材中總皂苷含量為1.46%，藥材提取后濃縮干燥得干浸膏，得率為21.4%。

2.2 胡蘆巴總皂苷正交提取

2.2.1 提取次數(shù)單因素試驗(yàn)

取4 份20 g 胡蘆巴，設(shè)置1，2，3，4 次的提取次數(shù)梯度，以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，溶劑倍數(shù)10 倍，提取時(shí)間2 h，每次進(jìn)行提取次數(shù)單因素試驗(yàn)，提取后各組不同次數(shù)提取液合并、混勻，測定體積，取適量過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷含量并計(jì)算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取次數(shù)單因素試驗(yàn)見表1，不同提取次數(shù)總皂苷提取率曲線見圖2。

表1 胡蘆巴總皂苷提取次數(shù)單因素試驗(yàn)

由圖2 可知，胡蘆巴提取3 次最佳，但2 次提取與3 次提取結(jié)果相差不大，綜合時(shí)間及成本考慮，采用2 次提取。

2.2.2 提取乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)

分別取20 g 胡蘆巴，設(shè)置0，20%，40%，60%，80%的提取乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度，以提取溫度80 ℃，10 倍溶劑，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2 次進(jìn)行提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)，提取后合并各組2 次提取液，混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度，并計(jì)算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)見表2，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的總皂苷提取率曲線見圖3。

表2 胡蘆巴總皂苷提取乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)

由圖3 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總皂苷提取率先升高再降低，40%體積分?jǐn)?shù)時(shí)最佳，因此可在正交試驗(yàn)時(shí)設(shè)置20%，30%，40%體積分?jǐn)?shù)梯度。

2.2.3 提取溶劑倍數(shù)單因素試驗(yàn)

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的總皂苷提取率曲線

取5 份20 g 胡蘆巴，設(shè)定8 倍，10 倍，12 倍，14 倍，16 倍的溶劑倍數(shù)梯度，以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h ，提取次數(shù)2 次，進(jìn)行不同溶劑倍數(shù)提取的單因素試驗(yàn)，提取后合并各組2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度并計(jì)算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取溶劑倍數(shù)單因素試驗(yàn)見表3，不同溶劑倍數(shù)提取的總皂苷提取率曲線見圖4。

表3 胡蘆巴總皂苷提取溶劑倍數(shù)單因素試驗(yàn)

圖4 不同溶劑倍數(shù)提取的總皂苷提取率曲線

由圖4 可知，隨著溶劑倍數(shù)的增加，總皂苷的提取率先升高，但達(dá)到一定倍數(shù)后，繼續(xù)升高溶劑倍數(shù)，總皂苷得率反而降低，因此溶劑倍數(shù)并非越大越好，溶劑倍數(shù)過大造成提取后濃縮干燥的時(shí)間能耗成本增加及一定的總皂苷損失，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)時(shí)可設(shè)定10 倍，12 倍，14 倍的溶劑倍數(shù)。

2.2.4 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

取5 份20 g 胡蘆巴，設(shè)定1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 的提取時(shí)間梯度，以30%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，提取次數(shù)2 次，進(jìn)行不同提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)，提取后合并各組的2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度并計(jì)算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取時(shí)間單因素試驗(yàn)見表4，不同提取時(shí)間下的總皂苷提取率曲線見圖5。

由圖5 可知，隨著提取時(shí)間的升高，總皂苷提取率逐步上升，在2.5 h 到達(dá)最高，3.0 h 提取2 次時(shí)提取率出現(xiàn)下降，正交試驗(yàn)時(shí)可設(shè)置2.0，2.5，3.0 h 的提取時(shí)間梯度。

表4 胡蘆巴總皂苷提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

圖5 不同提取時(shí)間下的總皂苷提取率曲線

2.2.5 提取溫度單因素試驗(yàn)

取5 份20 g胡蘆巴，設(shè)定45，55，65，75，85 ℃的提取溫度梯度，以30%乙醇為提取溶劑，12 倍溶劑，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2 次，進(jìn)行提取溫度的單因素試驗(yàn)，提取后合并各組的2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 方法測定總皂苷濃度并計(jì)算總皂苷提取率。

不同溫度提取胡蘆巴總皂苷的單因素試驗(yàn)見表5，不同溫度提取的總皂苷提取率曲線見圖6。

表5 不同溫度提取胡蘆巴總皂苷的單因素試驗(yàn)

圖6 不同溫度提取的總皂苷提取率曲線

由圖6 可知，提取溫度較低時(shí)總皂苷提取率非常低，隨著提取溫度的升高，總皂苷提取率在75 ℃時(shí)達(dá)到最大，因此正交試驗(yàn)時(shí)可設(shè)置65，75，85 ℃的提取溫度梯度。

2.3 胡蘆巴總皂苷的正交提取

2.3.1 正交提取

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，取9 份20 g 胡蘆巴，設(shè)置葫20%，30%，40%的乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度；10 倍，12 倍，14 倍的溶劑倍數(shù)梯度；2.0，2.5，3.0 h 的提取時(shí)間梯度；65，75，85 ℃的提取溫度梯度進(jìn)行正交試驗(yàn)，考查胡蘆巴總皂苷的最佳提取工藝。

胡蘆巴總皂苷正交試驗(yàn)因素見表6，胡蘆巴總皂苷正交提取試驗(yàn)結(jié)果見表7，胡蘆巴總皂苷提取率因素效應(yīng)曲線見圖7。

表6 胡蘆巴總皂苷正交試驗(yàn)因素

表7 胡蘆巴總皂苷正交提取試驗(yàn)結(jié)果

圖7 胡蘆巴總皂苷提取率因素效應(yīng)曲線

由正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知，胡蘆巴總皂苷提取因素影響大小依次為提取時(shí)間（C） ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） ＞提取溫度（D） ＞溶劑倍數(shù)（B），根據(jù)圖7 的效應(yīng)曲線預(yù)測胡蘆巴總皂苷最佳提取工藝為A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，溶劑倍數(shù)12 倍，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2.5 h，提取次數(shù)2 次。

胡蘆巴總皂苷正交提取試驗(yàn)方差分析見表8。

表8 胡蘆巴總皂苷正交提取試驗(yàn)方差分析

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

分別取20 g 胡蘆巴，以正交試驗(yàn)預(yù)測的最佳提取工藝為以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇，12 倍體積于75 ℃下提取2 次，每次2.5 h 為提取條件，設(shè)置3 組進(jìn)行提取，總皂苷提取率分別為77.14%，77.55%，76.53%，均值為77.07%，總皂苷得率均值為1.13%，RSD 為0.67%（n=3），結(jié)果波動(dòng)較小，且優(yōu)于正交試驗(yàn)各組結(jié)果，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡蘆巴總皂苷提取的因素影響大小依次為提取時(shí)間（C） ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A） ＞提取溫度（D） ＞溶劑倍數(shù)（B），根據(jù)圖7 的效應(yīng)曲線預(yù)測胡蘆巴總皂苷提取的最佳工藝為A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，溶劑倍數(shù)12 倍，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2.5 h，提取次數(shù)2 次。對該工藝進(jìn)行的3 組驗(yàn)證提取結(jié)果顯示，工藝穩(wěn)定可靠，可以有效從胡蘆巴中提取總皂苷，為胡蘆巴的應(yīng)用提供參考。