張建偉，王華東，郭寶印，李海波，孫鳳亮

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津301800

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。隨著我國人口老齡化加劇，前列腺癌的發(fā)病率不斷上升，已成為我國男性第五大常見惡性腫瘤［1］。有研究報(bào)道，晚期前列腺癌治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致患者生存期較短的主要原因［2］。但目前前列腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（lncRNA）可作為致癌基因或抑癌基因參與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）是lncRNA家族成員之一，基因定位于人染色體8q24.21 上，可參與染色質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關(guān)［4-5］。有研究報(bào)道，lncRNA PVT1能夠通過多種途徑參與腫瘤惡性進(jìn)展，并與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)［5-6］。但目前l(fā)ncRNA PVT1與前列腺癌關(guān)系的報(bào)道較少。2018年6月—2020年1月，本研究觀察了lncRNA PVT1對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細(xì)胞DU145、人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。lncRNA PVT1敲低質(zhì)粒（lncRNA PVT1 siRNA）、陰性對照質(zhì)粒（Negative Control siRNA），由湖南豐暉生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀，購自美國賽默飛公司；CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司；AlphaImager HP 凝膠成像系統(tǒng)，購自美國ProteinSimple 公司。G418，購自美國Amresco 公司。PrimeScript Reverse Transcriptase，購自瑞士Roche公司；SYBR Green Ⅰ核酸染料，購自北京索萊寶科技有限公司。PVT1、β-actin 一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將DU145 細(xì)胞接種于RPMI 1640 培養(yǎng)基，RWPE-1 細(xì)胞接種于含5 ng/mL 人重組表皮生長因子的角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并根據(jù)培養(yǎng)基pH 變化更換新的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長融合80%左右時(shí)，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化處理后，按1∶4傳代。

1.3 lncRNA PVT1 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。取傳3 代、對數(shù)生長期的DU145、RWPE-1 細(xì)胞各1×107個(gè)，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按PrimeScript Reverse Tran?scriptase 說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：40 ℃40 min，30 ℃10 min。以cDNA 為模板，按SYBR Green Ⅰ說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：lncRNA PVT1 上游引物5"-TAGGGTACGCTGCCG?TATGCT-3"，下游引物5"-CCGTACGTAGCCGTAT?GAGCT-3"；U6 上游引物 5"-CCTAAGTCCCGT?CAGTCGTGA-3"，下游引物 5"-GCTAGCGCCTC?CAGCTGTCG-3"。PCR 反應(yīng)體系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃20 s，95 ℃10 s、60 ℃20 s 共40 個(gè)循環(huán)，最后75 ℃10 s。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法 計(jì) 算lncRNA PVT1 mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選 取傳3 代、對數(shù)生長期DU145 細(xì)胞，以3.5×105個(gè)/孔接種于含RPMI 1640 培養(yǎng)基的6 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，隨機(jī)將細(xì)胞分為觀察組和對照組，按Lipofectamine2000說明，分別轉(zhuǎn)染lncRNA PVT1 siRNA和Negative Control siRNA，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染48 h，加入適量G418，使其終濃度分別為0、200、400、800、1 000 mg/L，每3～4 天更換1 次篩選培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～14 d，以細(xì)胞全部死亡的最低濃度為G418最佳篩選濃度。以G418最佳篩選濃度的一半維持培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，直至獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，分別檢測lncRNA PVT1 mRNA和蛋白表達(dá)。

lncRNA PVT1 mRNA 表達(dá)檢測采用RT-qPCR法，檢測步驟同1.3。

lncRNA PVT1蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法。收集上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。然后加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE（5%濃縮膠、10%分離膠）分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入PVT1、β-actin 一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，吸棄一抗，TBST沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG 二抗（稀釋比為1∶4 000），室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，在AlphaImager HP 凝膠成像系統(tǒng)中自動曝光。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測 采用MTT法。收集上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液200 μL 接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。分別于培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，室溫孵育4 h；棄上清液，加入DMSO 150 μL，充分混勻。酶標(biāo)儀于570 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以O(shè)D570值代表細(xì)胞增殖活性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)。收集上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基制成密度為2.5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液500 μL加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。然后將Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，用棉簽拭去未穿膜細(xì)胞，經(jīng)多聚甲醇固定和結(jié)晶紫染色，倒置相差顯微鏡下拍照觀察。隨機(jī)選取5個(gè)200倍不重疊視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。收集上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，制成密度為2×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液2 mL 接種于6孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合70%左右時(shí)，用10 μL 移液器吸頭垂直于孔底劃5 條平行劃痕，PBS 沖洗去除懸浮細(xì)胞，顯微鏡下拍照觀察并記錄劃痕距離（即0 h 劃痕距離）。吸棄原培養(yǎng)基，加入含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照觀察并記錄劃痕距離（即24 h 劃痕距離），計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DU145、RWPE-1 細(xì)胞lncRNA PVT1 mRNA 表達(dá)比較 DU145、RWPE-1 細(xì)胞lncRNA PVT1 mRNA相 對 表 達(dá) 量 分 別 為3.41 ± 0.81、1.00 ± 0.21，DU145細(xì)胞lncRNA PVT1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于RWPE-1細(xì)胞（t=7.938，P＜0.01）。

2.2 兩組lncRNA PVT1 表達(dá)比較 觀察組與對照組lncRNA PVT1 mRNA 相對表達(dá)量分別1.35 ±0.31、3.14±0.47，lncRNA PVT1蛋白相對表達(dá)量分別 為0.24 ± 0.04、0.88 ± 0.05。觀 察 組lncRNA PVT1 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均低于對照組（t分別為5.053、18.110，P均＜0.01）。

2.3 兩組細(xì)胞增殖活性比較 觀察組培養(yǎng)60、72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性均低于對照組同期（P均＜0.01），而兩組培養(yǎng)12、24、36、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 兩組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較（±s）

注：與對照組同時(shí)間比較，*P＜0.01。

組別對照組觀察組細(xì)胞增殖活性培養(yǎng)72 h 0.96±0.08 0.70±0.05*培養(yǎng)12 h 0.11±0.03 0.12±0.03培養(yǎng)24 h 0.10±0.03 0.18±0.05培養(yǎng)36 h 0.40±0.04 0.39±0.04培養(yǎng)48 h 0.56±0.04 0.52±0.05培養(yǎng)60 h 0.72±0.08 0.64±0.04*

2.4 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為（79.3±6.4）個(gè)，對照組為（144.7±9.5）個(gè)，觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組（t=6.982，P＜0.05）。

2.5 兩組細(xì)胞遷移能力比較 觀察組細(xì)胞遷移率為（23.3±2.1）%，對照組為（57.3±3.1）%，觀察組細(xì)胞遷移率明顯低于對照組（t=11.782，P＜0.01）。

3 討論

前列腺癌的發(fā)病率在全球男性所有惡性腫瘤中居第2位，病死率居第5位［7］。近年來隨著我國人口老齡化加劇，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為我國男性第五大常見惡性腫瘤［1］。內(nèi)分泌治療是目前前列腺癌的主要治療方法，幾乎所有患者在疾病早期屬于雄激素依賴型，雄激素剝奪療法的治療緩解率超過80%［8］。但經(jīng)過中位生存期14.30 個(gè)月以后，多數(shù)患者發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌，變得難以控制且易于轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致晚期前列腺癌死亡的主要原因。由于前列腺癌發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚，臨床對于去勢抵抗性前列腺癌缺乏有效的治療手段［9］。因此，深入研究前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，對其早期診斷和后續(xù)治療均具有重要意義。

lncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt 的非編碼RNA 分子，雖然不編碼蛋白，但可以RNA 的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)染后調(diào)控等層面上調(diào)控基因的表達(dá)。近年研究證實(shí)，lncRNA 可作為致癌基因或抑癌基因參與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［10］。PVT1 是lncRNA 家族成員之一，是人類多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要調(diào)控分子［11］。在乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞中抑制lncRNA PVT1 表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［12］。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中下調(diào)lncRNA PVT1表達(dá)可激活轉(zhuǎn)錄生長因子β 信號通路和凋亡信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1 在膀胱癌組織中異常表達(dá)，并與腫瘤臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是預(yù)測膀胱癌總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［14］。前期研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織lncRNA PVT1 表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，并且lncRNA PVT1高表達(dá)與前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］。由此推測，lncRNA PVT1 可能參與前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。但目前相關(guān)證據(jù)不足。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DU145 細(xì)胞lncRNA PVT1 mRNA 相對表達(dá)量明顯高于RWPE-1 細(xì)胞，與之前在前列腺癌組織中的報(bào)道一致。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將lncRNA PVT1 siRNA 轉(zhuǎn)染至DU145 細(xì)胞中，下調(diào)lncRNA PVT1 表達(dá)并通過G418 篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，進(jìn)一步觀察lncRNA PVT1 表達(dá)對DU145 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組培養(yǎng)60、72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性明顯低于對照組同期，即下調(diào)lncRNA PVT1 表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖；觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均低于對照組，即下調(diào)lncRNA PVT1 表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。結(jié)果表明lncRNA PVT1 可促進(jìn)DU145 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，與以往在卵巢癌細(xì)胞［16］、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞［17］中的報(bào)道一致。但目前對lncRNA PVT1在前列腺癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，前列腺癌細(xì)胞lncRNA PVT1 高表達(dá)，下調(diào)lncRNA PVT1 表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。lncRNA PVT1 有望成為前列腺癌早期診斷和靶向治療潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。