■徐曉麗 徐林通 鄭艷坤 任涵瑋 宋昀鵬 李 灝

(天津市水產(chǎn)研究所，天津300221)

隨著規(guī)模化、高密度、集約化的現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的快速發(fā)展，病害問題也接踵而至，2019 年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖因病害造成的經(jīng)濟損失約408億元[1]。而病害控制過程中的藥物濫用，不僅達不到預(yù)期效果，導(dǎo)致不可估量的經(jīng)濟損失，還會引起病原耐藥性產(chǎn)生，影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全，也給生態(tài)環(huán)境帶來一系列問題，嚴(yán)重制約著水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展。對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的防控有三條途徑，一是生態(tài)防控，通過采用各種生態(tài)養(yǎng)殖模式和技術(shù)措施，如多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖技術(shù)模式，降低養(yǎng)殖密度，通過食物鏈減少疾病傳播、避免病害發(fā)生；二是藥物防控，主要通過消毒劑定期對池水、食臺等進行消毒，減少水體中病原菌數(shù)量，采用微生態(tài)制劑產(chǎn)品，降低水體氨氮、亞硝酸鹽氮等，降解水體有機質(zhì)，促進水體菌藻平衡，同時在動物飼料中添加免疫增強劑（如多糖類物質(zhì)），提高養(yǎng)殖動物自身抗逆性，避免疾病發(fā)生；三是免疫預(yù)防，即對養(yǎng)殖動物接種疫苗，使其體內(nèi)產(chǎn)生對所接種疫苗的特異性免疫應(yīng)答，增強機體抗應(yīng)激的能力，提高免疫保護能力。其中免疫預(yù)防是一種相對安全有效、經(jīng)濟、環(huán)境友好、極具發(fā)展前途的水產(chǎn)疾病控制方式。

水產(chǎn)領(lǐng)域現(xiàn)有針對20多種水產(chǎn)病原的100多種魚類疫苗經(jīng)批準(zhǔn)上市，主要為減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗等，其中減毒活疫苗出于安全原因，在許多國家未獲準(zhǔn)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖；滅活疫苗、亞單位疫苗等高度純化的疫苗成分通常缺乏病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），不能有效激活先天免疫應(yīng)答而發(fā)生有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而造成對某些病原尤其是細胞內(nèi)病原的免疫保護效果不佳[2]。佐劑是一組能夠調(diào)節(jié)抗原固有免疫原性的結(jié)構(gòu)異質(zhì)化合物，并不引起機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可像PAMP一樣發(fā)揮作用，觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答，將疫苗組分識別為“威脅”，伴隨抗原呈遞細胞的激活和成熟，啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)，加強特異性免疫應(yīng)答強度，延遲免疫保護持續(xù)時間，減少疫苗副作用[2-3]。理想的佐劑能夠提高疫苗的有效性，無副作用，易于獲取及普遍應(yīng)用。近年來，疫苗佐劑的研究也引起越來越多的重視，新型疫苗佐劑要針對疫苗類型、作用方式及載體、免疫效率、免疫效果持久性以及佐劑本身毒性等方面進行研究，以更好地配伍疫苗，提高免疫保護效果[4]。

在魚類疫苗學(xué)中，含油佐劑應(yīng)用最為廣泛，幾乎所有鮭魚都注射油佐劑疫苗。其他如β-葡聚糖、殼聚糖、白介素、鞭毛蛋白等也可用作佐劑，其中β-葡聚糖是魚口服疫苗中目前使用最好的佐劑[5-6]。根據(jù)疫苗佐劑在免疫應(yīng)答中的作用，可將其分為兩類，信號1促進劑和信號2促進劑。前者在時間、位置和濃度上影響機體免疫應(yīng)答，最終提高其免疫效率，如油佐劑、納米/微米顆粒佐劑等；后者在抗原識別過程中提供共刺激信號，為抗原提供適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)環(huán)境，從而提高免疫效能，如鋁佐劑、Toll樣受體（TLR）配體等分子佐劑等?？乖ㄐ盘?）和附加次級信號（信號2）的呈遞都是激活特異性T和B淋巴細胞所必需的，從而形成免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫[7]。

1 信號1促進劑

1.1 油佐劑

油佐劑由礦物油、乳化劑和穩(wěn)定劑混合而成。魚類疫苗主要用油包水乳劑，抗原在佐劑的作用下緩慢釋放，由此誘導(dǎo)高效且持久免疫保護作用。Erkinharju等[8]比較了植物油及礦物油作為多聯(lián)疫苗佐劑對海參斑(Cyclopterus lumpus L.)的副作用，認為腹腔注射含礦物油佐劑疫苗引起的副作用相對較小，同時又可刺激魚體產(chǎn)生顯著高于對照組的免疫反應(yīng)。油佐劑中弗氏完全佐劑（FCA）應(yīng)用最為廣泛，注射后佐劑在動物體內(nèi)作為呈遞抗原的載體和貯存庫，使抗原緩慢釋放，通過MyD88 途徑持續(xù)刺激動物產(chǎn)生強烈的Th1 和Th17反應(yīng)，產(chǎn)生較高的免疫力[9]。但使用FCA也有一定的副作用，如不易注射，注射部位的肉芽腫等。Zhang等[10]在五價疫苗中分別使用黃芪多糖、蜂膠和FCA作為佐劑，結(jié)果顯示FCA誘導(dǎo)的免疫刺激活性效果優(yōu)于黃芪多糖和蜂膠。但不是所有疫苗使用FCA均可提高免疫原性，如福爾馬林滅活的海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)疫苗本身可為虹鱒(Oncorhynchus mykiss)提供良好的保護，加入FCA后這種保護作用并未顯著增強[11]。由于FCA對受免動物的副作用，逐漸被去除分枝桿菌成分的弗氏不完全佐劑（FIA）取代，毒性明顯降低。對虹鱒乳球菌病的疫苗研究發(fā)現(xiàn)，福爾馬林滅活的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)菌苗及混合FIA的菌苗分別腹腔注射免疫虹鱒，125 d后的感染實驗發(fā)現(xiàn)，無佐劑組的相對存活率（RPS）為54%，而FIA組的RPS提高到85%[12]。

為提高疫苗制劑的功效和穩(wěn)定性，減少副作用，以Montanide商標(biāo)注冊的優(yōu)化礦物油佐劑上市。這類佐劑使用甘露醇油酸酯作為特定表面活性劑，可用于生產(chǎn)不同類型的用于哺乳動物和魚類的乳劑[7]。Hwang 等[13]在褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性出血性敗血癥（Viral hemorrhagic septicemia，VHS）浸泡疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，以Montanide IMS 1312 VG 作為疫苗佐劑與熱滅活的VHS 病毒FP-VHS2010-1 菌株（VHSV），健康魚在（20±2）℃下浸泡接種5 min，可增強免疫相關(guān)基因（IL-1β、IL-6、IL-8和TLR3）的表達，提高魚類的RPS。此外，Montanide ISA-763也被用作格氏乳球菌和嗜水氣單胞菌二聯(lián)疫苗的佐劑，對虹鱒魚具有很好的免疫保護力[14]。

1.2 納米/微米粒子佐劑

微粒作為疫苗遞送載體得到研究人員的廣泛關(guān)注，抗原與微粒以共價結(jié)合或物理包埋結(jié)合在一起，所需的抗原量更少，抗原呈遞效率更高，低劑量的抗原即可刺激機體產(chǎn)生最佳的體液免疫反應(yīng)，存儲更穩(wěn)定，材料易回收。微米聚合物顆粒被認為是哺乳動物系統(tǒng)中的最具潛力的佐劑[15]。

PLGA[poly-(D,L-lactic-co-glycolic)-acid]納米/微米粒子具有良好的生物相容性和可降解性，其作為疫苗抗原載體的研究已經(jīng)進行了20 多年。PLGA 顆?？煞庋b一種或多種抗原，抗原通過基質(zhì)孔擴散及基質(zhì)降解而從微球中釋放出來，提高了抗原釋放的可預(yù)測性。生物降解速率可以通過改變聚合物組成和分子量來調(diào)節(jié)。另外，表面相關(guān)抗原的即時持續(xù)釋放可能有助于快速反應(yīng)及介導(dǎo)長期的免疫保護[16-17]。H?lvold等[17]研究了納米級（320 nm）和微米級（4 μm）PLGA顆粒肌肉注射接種魚體后引起的免疫反應(yīng)。將編碼熒光素酶（Photinus pyralis）基因的質(zhì)粒載體分別封裝在兩種不同大小的PLGA 顆粒中，肌內(nèi)注射大西洋鮭(Salmo salar)，分析肌肉、頭腎和脾多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示兩種大小的PLGA 顆粒都能在注射部位誘導(dǎo)促炎性免疫反應(yīng)，微米級PLGA 顆粒與油佐劑炎性病理變化相近，而納米級PLGA 顆粒在魚體內(nèi)分布類似于裸pDNA的分布，同時魚體中抗病毒基因的表達明顯上調(diào)，這為病毒DNA疫苗的研究提供了參考和依據(jù)。PLGA封裝疫苗也可通過浸浴對魚進行免疫，能夠顯著上調(diào)IgM、IgT、pIgR、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、IFN-γ 和Caspase3 等免疫相關(guān)基因的表達，說明PLGA載體可有效保護滅活的病毒抗原并將其運輸至免疫器官，刺激魚體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答[18]。

2 信號2促進劑

2.1 鋁佐劑

磷酸鋁和氫氧化鋁是少數(shù)可用于人類疫苗的佐劑。鋁佐劑幾乎僅誘導(dǎo)Th2反應(yīng)，對促進體液免疫特別有效。明礬也是鋁佐劑的一種，作為一種晶體，能夠強力結(jié)合樹突狀細胞質(zhì)膜脂質(zhì)，獨立于炎癥小體和膜蛋白，隨后的脂質(zhì)分選激活了導(dǎo)致抗原攝取的無效吞噬反應(yīng)。這種活化的樹突狀細胞不與明礬進一步結(jié)合，而是通過細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）表現(xiàn)出高親和力和與CD4+T細胞的穩(wěn)定結(jié)合[19]。鋁佐劑在用于魚類疫苗的研究較少，Hoare 等[20]研究了角鯊烯/氫氧化鋁作為佐劑的嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）滅活疫苗，免疫大西洋鮭進行攻毒，可顯著提高受免魚的RPS，且角鯊烯/鋁佐劑比傳統(tǒng)的油佐劑安全，更易被魚體代謝，引起的組織炎性反應(yīng)較輕。

2.2 β-葡聚糖，dectin-1的配體

葡聚糖作為一種免疫增強劑，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物免疫中，主要是β-1,3-D-葡聚糖，可通過刺激dectin-1參與的哺乳動物和魚類非特異性免疫反應(yīng)，顯著提高魚體細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答[21-22]。在鯉魚嗜水氣單胞菌疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，在免疫接種之前提前腹腔注射β-葡聚糖，可顯著提高魚體內(nèi)白細胞數(shù)量，刺激巨噬細胞產(chǎn)生超氧陰離子，同時誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生更高的抗體效價，有助于迅速殺滅病原體，而免疫前浸浴或口服β-葡聚糖并不能增強免疫反應(yīng)[23]。作為一種可溶性佐劑，β-葡聚糖在浸浴免疫中也顯示出較好的效果。一項針對虹鱒魚的研究結(jié)果顯示，疫苗中添加β-葡聚糖可顯著上調(diào)虹鱒鰓細胞中黏膜免疫相關(guān)基因[24]。

2.3 皂苷

皂苷是類固醇或三萜的天然糖苷，能夠刺激Th1和Th2反應(yīng)，已廣泛用于不同哺乳動物的佐劑中。使用最廣泛的皂苷是Quil-A (ISCOM成分)及其衍生物，但是由于其高細胞毒性和在水相中的不穩(wěn)定性，人們正在探索使用不同皂苷[25]。皂苷在魚用疫苗中尚未有更為深入的研究。

2.4 分子佐劑

分子佐劑是信號2促進劑，包括相當(dāng)數(shù)量的TLR和多種細胞因子等。與哺乳動物相比，硬骨魚類的TLR數(shù)量可能是哺乳動物的近兩倍。通常，那些在配體結(jié)合后誘導(dǎo)IL-12 產(chǎn)生的TLR 傾向于Th1 反應(yīng)（TLR 3、4、5、7、8、9 和11），此外，這些TLR 的激活可能會誘導(dǎo)抗原交叉呈遞，在某些條件下促進細胞毒性T 細胞應(yīng)答，與TLR 3、4、7 和9 結(jié)合的配體也可能通過干擾素調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)Ⅰ型IFN反應(yīng)[26-28]。

2.4.1 Poly I：C，TLR3激動劑

聚肌苷酸聚胞苷酸（Poly I：C）是一種雙鏈多核糖核苷酸，能夠模仿病毒感染，因此被廣泛用于包括魚類在內(nèi)的多個物種中誘導(dǎo)I型干擾素（IFN），也是一種免疫增強劑[27，29]。IFN 在病毒感染的早期防御中起主要作用，Poly I：C 與TLR3 結(jié)合，隨后激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)后，誘導(dǎo)非特異性抗病毒狀態(tài)產(chǎn)生。Chang 等[30]構(gòu)建傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）血凝素酯酶（HE）基因作為抗原的DNA 疫苗，以編碼I 類大西洋鮭魚IFN（IFNa1、IFNb 或IFNc）的質(zhì)粒作為佐劑免疫大西洋鮭，結(jié)果顯示，三種IFN 質(zhì)粒均可有效提高鮭魚對ISAV 的免疫保護，并刺激了針對該病毒的抗體水平的提高。Kim 等[31]對褐牙鲆病毒性出血性敗血?。╒HS）疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先注射了Poly I：C 可顯著提高疫苗的保護效果及相對存活率，活疫苗比福爾馬林滅活疫苗可提供更好的保護作用。Thim等[32]以Salmonid alphavirus (SAV)為抗原，分別以兩種TLR配體、CpG 基序和Poly I：C 及表達VHSV 糖蛋白的DNA 質(zhì)粒載體作為佐劑，免疫大西洋鮭，結(jié)果顯示CpG/ Poly I：C 能夠同時提高魚體先天性免疫和適應(yīng)性免疫，可作為病毒類疫苗佐劑的研究方向之一。

2.4.2 鞭毛蛋白-TLR5激動劑

鞭毛蛋白為革蘭氏陰性菌鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白。鞭毛蛋白是先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)內(nèi)多種類型細胞的有效激活劑。研究證明鞭毛蛋白通過TLR5信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)Th1 和Th2 的免疫反應(yīng)，能夠促進細胞因子產(chǎn)生[33]。Jiao 等[34]在研究褐牙鲆遲緩愛德華氏菌疫苗組成中發(fā)現(xiàn)，最有前景的疫苗為一種編碼E. tarda Eta6蛋白融合該菌鞭毛蛋白Flic 框架的嵌合體DNA 疫苗。雖然遲緩愛德華氏菌鞭毛蛋白Flic 本身誘導(dǎo)較低的免疫保護，但可作為分子佐劑增強由E. tarda Eta6 誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，刺激先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達（IL-1β、IFN、Mx、CD8α、MHC-Ⅰα、MHC-Ⅱα、IgM)[35]。張華[36]以大菱鲆為研究對象，篩選了13 種不同的遲緩愛德華氏菌滅活疫苗佐劑，其中以鞭毛蛋白FlgD 為佐劑的疫苗組獲得良好的免疫保護效果，相對免疫保護率達到70%，魚體內(nèi)抗體水平在免疫第3 周達到最大值，免疫相關(guān)基因如MHC-I、IgM、IL-1β、TCR 和TNFα等均上調(diào)表達。

2.4.3 CpG-TLR9激動劑

CpG基序是指由非甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤核苷酸組成的具有免疫調(diào)節(jié)作用的一段寡核苷酸序列，與合成寡脫氧核苷酸（ODN）可觸發(fā)免疫刺激級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)分泌多種細胞因子，誘導(dǎo)多種免疫細胞（如B和T淋巴細胞、NK 細胞、單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞）的成熟、分化和增殖，還可誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，CpG-DNA 序列具有免疫佐劑特性，可輔助刺激機體產(chǎn)生特異性及非特異性免疫應(yīng)答，增強疫苗的免疫原性[7]。CpG基序在哺乳動物中比在微生物DNA中約低20 倍，被表達TLR9 的細胞識別為危險信號，CpGODNs用作佐劑能夠加速和增強免疫反應(yīng)[37-38]。在魚類中，已經(jīng)對CpGs的免疫調(diào)節(jié)作用進行了許多研究，但將其作為佐劑的研究較少。Liu等[39-40]研究了CpG基序?qū)Υ罅怫液秃盅丽业谋Ｗo作用，合成了16 個CpGODN，檢測了其在褐牙鲆血液中抑菌能力，選擇四個抑菌作用最強的ODNs，構(gòu)建質(zhì)粒pCN6，肌肉注射褐牙鲆4周后用嗜水氣單胞菌進行感染實驗，20 d后統(tǒng)計死亡率，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組死亡率（30%）明顯低于空質(zhì)粒組（66.7%）和PBS對照組（63.3%）；以遲緩愛德華氏菌進行的感染實驗結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組死亡率為53.3%，空質(zhì)粒組死亡率為90%，PBS對照組死亡率為93.3%。pCN6質(zhì)粒提供了針對嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌的非特異性免疫保護，這種免疫保護也可對抗寄生蟲及病毒的感染。另有研究發(fā)現(xiàn)含有CpG 和Poly I：C聯(lián)合作為佐劑的SAV疫苗可誘導(dǎo)魚體大量中和抗體的產(chǎn)生，SAV陽性魚的比例明顯減少[41]。

2.4.4 細胞因子

目前，人類已經(jīng)識別并測序了魚類的許多細胞因子基因，但很少有關(guān)于細胞因子作為魚類疫苗佐劑的研究，對許多細胞因子的免疫調(diào)節(jié)機制仍不明確。白細胞介素8（IL-8）是一種CXC 趨化因子，哺乳動物的多種類型細胞（如巨噬細胞、單核細胞、上皮細胞、嗜中性粒細胞和成纖維細胞）在病原感染后、IL-1β或TNFα刺激后均可產(chǎn)生IL-8。在哺乳動物中，趨化因子已被廣泛用作病毒疫苗的佐劑，因為它們不僅吸引更多的細胞參與炎癥反應(yīng)，還調(diào)節(jié)細胞的免疫功能[7]。在魚類中，虹鱒IL-8 的特征是其化學(xué)引誘特性，將編碼VHSV糖蛋白基因的質(zhì)粒疫苗與編碼虹鱒IL-8的質(zhì)粒共同注射，發(fā)現(xiàn)脾臟及接種處IL-1β明顯增加，單獨注射IL-8 可刺激脾臟中TNF-α、IL-11、TGF-β和IL-18的明顯高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-8用作佐劑時，也可調(diào)節(jié)其他趨化因子如CK6、CK5B、CK7和CK5A的表達，表明IL-8能夠調(diào)節(jié)魚類早期抗病毒免疫反應(yīng)，可能是有效的疫苗佐劑[42]。納米結(jié)構(gòu)的TNFα蛋白（IBsTNFα）也可能為魚類潛在的黏膜佐劑，可經(jīng)腸黏膜吸收進入肌肉層，上調(diào)斑馬魚腸道和脾臟的促炎細胞因子IL-6、IL-1β、IL-10及炎癥調(diào)節(jié)細胞因子mmp9、Cox2，保護魚類免受海分枝桿菌的感染[43]。

3 中草藥佐劑

許多中藥(蜂膠、人參、當(dāng)歸及蘆薈等)的主要活性成分為多糖，常見的如黃芪多糖、枸杞多糖、香菇多糖、銀耳多糖等，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強單核細胞吞噬功能以及T、B細胞的免疫功能，但目前研究基礎(chǔ)十分薄弱。任燕等[44]研究了蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷(Castor oil polyethylene glycol monoester glucoside, CPMG)對滅活細菌浸泡疫苗的佐劑效應(yīng)，免疫30 d后進行攻毒，同時用含CPMG和山莨菪堿復(fù)合佐劑的滅活疫苗二次浸泡免疫試驗魚，30 d后，CPMG組的相對保護率為70.6%，復(fù)合佐劑組為88.2%，均顯著高于無佐劑組的56.0%。劉冉陽[45]制備了甲醛滅活哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)疫苗，分別以黃芪多糖和蒲公英多糖為佐劑，評價疫苗的保護效果，結(jié)果顯示接種蒲公英多糖配合疫苗組的相對免疫保護率為82.46%，黃芪多糖配合疫苗保護率為78.95%，滅活疫苗的保護率為73.68%，兩種多糖作為免疫佐劑均能夠提升哈維氏弧菌滅活疫苗對牙鲆的保護效果。中草藥佐劑在安全性方面具有一定優(yōu)勢，但目前研究基礎(chǔ)十分薄弱，僅從其對免疫保護力、抗體水平、免疫細胞及免疫因子的調(diào)節(jié)表達來研究佐劑效應(yīng)，其作用機理仍不明確。

4 小結(jié)

佐劑在疫苗中已經(jīng)使用了90多年，用于增強機體對抗原的免疫反應(yīng)。對于新型疫苗研發(fā)來說，純化的保護性抗原與特異性和靶向性佐劑的輔助同等重要，佐劑已成為許多疫苗的必要組成部分。佐劑有助于抗原觸發(fā)特定的免疫過程，減少強烈副作用的產(chǎn)生，使疫苗免疫原性及引起的免疫應(yīng)答最大化。因此，抗原和佐劑的正確匹配可以增強適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而能夠開發(fā)出新的有效疫苗。但由于對新型佐劑（例如TLR配體或細胞因子）的功效及作用機制和配伍的基礎(chǔ)研究不夠深入，新型佐劑尚未用于商業(yè)化疫苗生產(chǎn)，目前商業(yè)化的魚類疫苗仍使用油佐劑。在未來的疫苗研究中，應(yīng)明確疫苗各組分組成中各物質(zhì)的免疫功能，綜合評價疫苗效價和功效，促使疫苗行業(yè)從油佐劑轉(zhuǎn)向能夠特異性地觸發(fā)足夠免疫反應(yīng)的新型佐劑，從而獲得針對特定病原體尤其是病毒性病原的高效疫苗。