■曹 慧 任世威 張騰月，2 秦亞寧，3 張 蘭，4 楊佳萌 張朋振

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471000；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川成都611130；4.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都610041)

植物中的結(jié)構(gòu)性多糖主要是纖維素與半纖維素[1]，能將兩者降解為可溶性糖的酶被稱(chēng)為纖維素酶和半纖維素酶[2]。纖維素酶在飼料、紡織、食品加工中均有廣泛應(yīng)用[3-4]。纖維素降解過(guò)程中，半纖維素酶對(duì)纖維素酶的水解效率有促進(jìn)作用[5]。反芻動(dòng)物飼料中含有大量的纖維素與半纖維素，但動(dòng)物消化道自身不產(chǎn)生纖維素酶，無(wú)法直接高效利用纖維素[6]。我國(guó)早在20 世紀(jì)90 年代便開(kāi)始了對(duì)飼用酶制劑的研究與應(yīng)用[7]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶與半纖維素酶廣泛應(yīng)用在反芻動(dòng)物飼用酶制劑中。商業(yè)酶制劑的最適作用溫度普遍為60 ℃[2]，與反芻動(dòng)物瘤胃的溫度（39 ℃）[8]差別較大，影響纖維素酶的水解效率。因此，篩選適應(yīng)低溫環(huán)境的纖維素降解菌成為近年的研究熱點(diǎn)。

青藏高原平均海拔4 000 m 以上，具有海拔高、輻射強(qiáng)、低溫、低氧等特點(diǎn)，其獨(dú)特的自然氣候和地域特征，使得土壤微生物對(duì)青藏高原特殊生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了特有的生理適應(yīng)機(jī)制[9-10]。權(quán)淑靜等[11]從青藏高原土壤樣品中篩選出低溫條件下產(chǎn)蛋白酶的菌株LS20-2，被鑒定為皮氏類(lèi)芽孢桿菌。謝占玲等[12]從青海湖中分離到617株耐鹽真菌，首次系統(tǒng)研究了青海湖中耐鹽真菌的多樣性，展示了青海湖中豐富的耐鹽真菌資源。本研究旨在通過(guò)對(duì)青藏高原土壤微生物中低溫纖維素降解菌株的篩選與酶學(xué)特性研究，以期尋找新的纖維素酶資源，為高原菌種資源利用提供科學(xué)依據(jù)，為我國(guó)飼用酶制劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

用梅花形采樣法，從青藏高原冷地早熟禾草地采集土壤樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂17 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

純化培養(yǎng)基：200 g 土豆浸出液、葡萄糖20 g、KH2PO40.02 g、MgSO4·7H2O 0.015 g、瓊脂20 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g、蛋白胨3 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、純化水1 L，pH值5.5～6.0。

上述培養(yǎng)基均需121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

CMC-Na（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、木聚糖（自提玉米芯木聚糖，提取方法參考趙龍妹等[13]）、DNS（3，5-二硝基水楊酸，配置方法參考王明瑞等[14]）、Triton X-100基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、葡萄糖、MgSO4·7H2O（江蘇強(qiáng)盛化工有限公司）、K2HPO4、KH2PO4（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、瓊脂粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.1.4 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（Bio-Rad laboratories Inc）、高壓滅菌鍋、氣浴恒溫振蕩器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、恒溫水浴鍋（上?？畦巸x器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

初篩：10 g 土壤樣品、90 mL 無(wú)菌水于錐形瓶中，20 ℃、200 r/min 混勻30 min，取10-2土壤稀釋液200 μL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)72 h，選取單菌落純化培養(yǎng)。純化后的菌株點(diǎn)接種于篩選培養(yǎng)基，20 ℃培養(yǎng)72 h，用剛果紅染色法[15]觀察菌落透明圈，測(cè)量菌落直徑（d）及透明圈直徑（D），選擇D/d值較大的菌株為初篩菌株。

復(fù)篩：初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液12 000 r/min 離心10 min 制備粗酶液，進(jìn)行纖維素酶活力測(cè)定，選取酶活力最大的菌株為目標(biāo)菌株，并測(cè)定半纖維素酶活力。

1.2.2 纖維素酶活力的測(cè)定

0.25 mL粗酶液與0.25 mL底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）混勻，40 ℃水浴反應(yīng)30 min，立即加入0.75 mL DNS 終止反應(yīng)，沸水浴顯色10 min，冷卻至室溫，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

酶活力定義：在40 ℃，pH 值6 時(shí)，每分鐘水解底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）產(chǎn)生1 μg還原糖對(duì)應(yīng)的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 半纖維素酶活力的測(cè)定

0.3 mL 粗酶液與0.45 mL 底物（1%木聚糖溶液）混勻，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，立即加入0.75 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴顯色10 min，冷卻至室溫，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

酶活力定義：在50 ℃，pH 值6 時(shí)，每分鐘水解底物（1%木聚糖溶液）產(chǎn)生1 μg木糖對(duì)應(yīng)的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：菌株于純化培養(yǎng)基培養(yǎng)后，觀察菌落與菌體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。分子生物學(xué)鑒定：用Triton X-100 基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。參照孫佑赫等[16]的方法，用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò) 增 菌 株16S rRNA基因序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法[16]對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

菌株發(fā)酵液離心制備粗酶液，進(jìn)行相對(duì)酶活力測(cè)定。不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）下測(cè)定纖維素酶和半纖維素酶的相對(duì)酶活力確定最適反應(yīng)溫度。不同pH值條件（4、5、6、7、8、9、10）測(cè)定纖維素酶和半纖維素酶的相對(duì)酶活力確定最適pH 值。測(cè)定酶的溫度穩(wěn)定性，在不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）下保溫30 min 后測(cè)定纖維素酶和半纖維素酶相對(duì)酶活力。測(cè)定酶的pH 值穩(wěn)定性，在不同pH 值（4、5、6、7、8、9、10）下保溫1 h 后測(cè)定纖維素酶和半纖維素酶相對(duì)酶活力。測(cè)定濃度為10 mmol/L 的不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+）對(duì)纖維素酶和半纖維素酶相對(duì)酶活力的影響。

1.4 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

將該菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，每6 h取1次，測(cè)定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

通過(guò)菌落透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（見(jiàn)圖1）和酶活力大小的比較，篩選出一株低溫纖維素降解菌LD19，該菌株還具有產(chǎn)半纖維素酶的能力。

2.2 菌株的鑒定

形態(tài)鑒定：該菌株為白色不規(guī)則圓形菌落，不透明，中央微凸，難挑取（見(jiàn)圖2）。菌絲彎曲較細(xì)，呈絲狀（見(jiàn)圖3），初步鑒定為放線菌。

圖1 菌株LD19菌落透明圈

圖2 菌株LD19菌落形態(tài)

圖3 菌株LD19菌絲形態(tài)

分子鑒定：該菌株與已知菌株Streptomyces clavifer的16S rDNA序列相似度為99%，確定菌株LD19為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer）。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.3.1 酶的最適反應(yīng)溫度（見(jiàn)圖4）

不同溫度下測(cè)定纖維素酶相對(duì)酶活力與半纖維素酶相對(duì)酶活力，以最大相對(duì)酶活力值為100%。由圖4 可知，纖維素酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，屬低溫纖維素酶，20～40 ℃時(shí)相對(duì)酶活力不斷增大，40 ℃后相對(duì)酶活力逐漸降低；半纖維素酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，20～50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力不斷增大，50 ℃后相對(duì)酶活力迅速降低。

圖4 酶的最適反應(yīng)溫度

2.3.2 酶的溫度穩(wěn)定性（見(jiàn)圖5）

圖5 酶的溫度穩(wěn)定性

由圖5 可知，在40 ℃保溫處理30 min 纖維素酶和半纖維素酶相對(duì)酶活力均達(dá)到最高。纖維素酶在30～70 ℃時(shí)仍能保持較高相對(duì)酶活力，半纖維素酶在50～70 ℃時(shí)相對(duì)酶活力僅在40%左右。

2.3.3 酶的最適反應(yīng)pH值（見(jiàn)圖6）

由圖6 可知，該纖維素酶與半纖維素酶在pH 值為6時(shí)酶活力均達(dá)到最高，最適反應(yīng)pH值均為6。纖維素酶在pH 值4～10 時(shí)能保持75%以上的相對(duì)酶活力，說(shuō)明該纖維素酶pH 值適應(yīng)范圍較廣。半纖維素酶在pH 值4～8 是相對(duì)酶活力維持在80%左右，pH 值大于8后相對(duì)酶活力迅速下降，說(shuō)明該半纖維素酶適用于弱酸性和中性環(huán)境。

圖6 酶的最適反應(yīng)pH值

圖7 酶的pH值穩(wěn)定性

2.3.4 酶的pH值穩(wěn)定性（見(jiàn)圖7）由圖7可知，該纖維素酶在pH值4～10處理1 h后仍能保持90%以上的相對(duì)酶活力，該半纖維素酶在pH值9時(shí)仍有60%以上相對(duì)酶活力，說(shuō)明這兩種酶在酸性和堿性環(huán)境下均有良好的耐受性。

2.3.5 不同金屬離子對(duì)相對(duì)酶活力的影響（見(jiàn)圖8）

圖8 金屬離子對(duì)酶的相對(duì)酶活力的影響

圖8可知，不同金屬離子對(duì)纖維素酶和半纖維素酶相對(duì)酶活力的影響存在明顯差異，以不添加金屬離子時(shí)的相對(duì)酶活力為100%。除Zn2+對(duì)纖維素酶相對(duì)酶活力具有抑制作用外，Ca2+、Mn2+、Cu2+等對(duì)纖維素酶相對(duì)酶活力都具有激活作用。Cu2+對(duì)半纖維素酶相對(duì)酶活力的激活作用最大，Na+、K+等對(duì)半纖維素酶相對(duì)酶活力具有抑制作用。

2.4 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定（見(jiàn)圖9）

圖9 菌株LD19產(chǎn)酶曲線

由圖9 可知，菌株LD19 所產(chǎn)纖維素酶與半纖維素酶活力在0～96 h 均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，102 h 時(shí)纖維素酶活力為21.6 U/mL，半纖維素酶活力為16.8 U/mL，同時(shí)達(dá)到酶活力最大值，之后酶活力開(kāi)始下降。

3 討論

纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物[17]，但其中89%左右的纖維素資源未能開(kāi)發(fā)利用，不僅造成大量的資源浪費(fèi)，還造成了環(huán)境污染問(wèn)題[6]。微生物產(chǎn)酶降解纖維素具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)保、高效、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[18]，在自然界和工業(yè)生產(chǎn)中，纖維素的降解幾乎都是通過(guò)生物降解法完成的[19]。自然界中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物主要有真菌、細(xì)菌和放線菌。真菌對(duì)纖維素的降解能力比較突出，具有分泌酶系全面、酶量大、酶活力高等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于酶制劑生產(chǎn)[20]。細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短、生長(zhǎng)速度快、耐高溫等優(yōu)點(diǎn)，許多高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌從不同的環(huán)境分離出來(lái)并被廣泛研究應(yīng)用[21]。相較于真菌和細(xì)菌，放線菌生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)量較低，所以目前對(duì)放線菌的研究相對(duì)較少。有研究表明，放線菌的耐熱性和對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)[22]。

本研究中篩選出的菌株LD19經(jīng)鑒定為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer），能同時(shí)產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。Meij 等[23]從野生擬南芥的根部分離出優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌Streptomyces clavifer，該菌特殊的定植方式使其在根部組織中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。Balakrishnan 等[24]從印度尼西亞野生動(dòng)物保護(hù)區(qū)土壤樣品中分離出的菌株Streptomyces clavifer TBG-MNR13（MTCC4150）有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶能力。鏈霉菌是自然界中最豐富的放線菌，能產(chǎn)生多種纖維素酶與半纖維素酶[24-25]，二者在木質(zhì)纖維素降解過(guò)程中起協(xié)同作用，將纖維素降解為葡萄糖，將半纖維素降解為低聚木糖、木糖和阿拉伯糖等降解產(chǎn)物[26]，應(yīng)用于畜牧行業(yè)能降低食糜黏度、減少飼料內(nèi)源損失、改善腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，從而改善畜禽生產(chǎn)性能，提高養(yǎng)分和能量的利用效率[27]。孫曉萌等[22]通過(guò)對(duì)降解木質(zhì)纖維素放線菌的功能組學(xué)分析證實(shí)了放線菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力及其巨大的工業(yè)應(yīng)用前景。楊彬等[28]從荔枝腐葉中篩選出一株具有木質(zhì)纖維素降解能力的綠木霉（Trichoderma virens），能同步分泌高效纖維素酶和木聚糖酶，具有應(yīng)用于木聚糖酶和木寡糖生產(chǎn)的潛力。李鵬飛等[6]從綿羊糞便中分離篩選出一株能夠產(chǎn)生高活力纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的目的菌B5，經(jīng)鑒定B5菌株為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），對(duì)飼料粗纖維降解效率與酶活力顯著相關(guān)。李師翁等[29]從青藏高原采集的牦牛糞中分離得到一株產(chǎn)低溫纖維素酶能力較強(qiáng)的放線菌，初步鑒定為鏈霉菌屬。

菌株LD19不僅能同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶，而且所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度與pH 值和反芻動(dòng)物瘤胃條件相似，酶的溫度穩(wěn)定性與pH 值穩(wěn)定性較好，增加了該菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用性。研究發(fā)現(xiàn)[30-32]，將纖維素酶與半纖維素酶結(jié)合應(yīng)用到反芻動(dòng)物飼糧中，可以提高飼料利用效率，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，所以該菌株在飼用酶制劑中有較大的應(yīng)用潛力。但是將該菌株所產(chǎn)纖維素酶與半纖維素酶作為飼用酶制劑應(yīng)用于反芻動(dòng)物的實(shí)際生產(chǎn)中還須做很多工作，飼用酶制劑的添加方式、添加量、添加時(shí)間等都有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究從青藏高原冷地早熟禾田土壤中篩選出一株低溫纖維素酶降解菌LD19，該菌株具有產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的能力。通過(guò)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定確定LD19 為釘斑鏈霉菌（Streptomyces clavifer）。菌株LD19在20 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)102 h時(shí)纖維素酶與半纖維素酶活力均達(dá)到最高值，纖維素酶活力為21.6 U/mL，半纖維素酶活力為16.8 U/mL。進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)初步研究，結(jié)果表明：該纖維素酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，屬低溫纖維素酶，最適pH 值為6，在30～70 ℃、pH值4～10時(shí)纖維素酶相對(duì)酶活力較穩(wěn)定，Mn2+、Ca2+、Cu2+等對(duì)該纖維素酶有激活作用，Zn2+對(duì)該酶有抑制作用；該半纖維素酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適pH值為6，30～40 ℃處理30 min后剩余相對(duì)酶活力在40%左右，pH 值4～9 時(shí)相對(duì)酶活力穩(wěn)定，Cu2+、Mn2+、Fe3+對(duì)該半纖維素酶有促進(jìn)作用，Zn2+對(duì)該酶的抑制作用最大。