歐陽(yáng)浩　蔣君梅　杜巧麗　方遠(yuǎn)鵬　李向陽(yáng)　謝鑫

摘 要：Shaker蛋白家族是植物體攝入鉀元素的重要通道，其對(duì)植物環(huán)境耐受性發(fā)揮著重要的作用。本研究在高粱全基因組中鑒定了Shaker蛋白家族成員，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，高粱中共鑒定到9個(gè)Shaker家族成員，共可分為5個(gè)亞族，且處于同一個(gè)亞族的基因結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似;亞細(xì)胞定位顯示，這些成員均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上;共線性分析結(jié)果表明，高粱Shaker蛋白家族在禾本科的進(jìn)化歷程中相對(duì)保守;組織特異性及模擬干旱表達(dá)結(jié)果顯示，Shaker成員具有明顯的組織特異性與干旱應(yīng)答差異。本研究有望為進(jìn)一步研究高粱Shaker蛋白家族的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高粱;Shaker家族;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S514? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31801691，32060614）;貴州省科技計(jì)劃（黔科合支撐[2019]2408）;貴州省高層次留學(xué)人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（[2018]02）;大學(xué)生“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目（貴大SRT字[2019]329）

文章編號(hào)：1008-0457（2021）05-0001-09? ? 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.05.001

Identification and Bioinformatics Analysis of Shaker Protein Family of Potassium Channels in Sorghum

OUYANG Hao1，JIANG Junmei1，2，DU Qiaoli1，F(xiàn)ANG Yuanpeng1，LI Xiangyang2，XIE Xin1*

（1.Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Shaker protein family is an important channel of potassium uptake for plant，which plays an important role in plant environmental tolerance.Here，members of the Shaker protein family were identified in the whole genome of sorghum and thenanalyzed by bioinformatics.The results showed that a total of 9 Shaker members were identified in sorghum，which could be divided into 5 subfamilies.Gene structure and protein structure of members of the same subfamily were similar.The results of subcellular localization showed that all these members were located on the cytoplasmic membrane.Based on the results of collinear analysis，the Shaker protein family of sorghum was relatively conservative in the evolution of Gramineae.According to the results of tissue specificity and simulated drought expression showed that Shaker members had significant differences in tissue specificity and drought response.In words，this study is expected to provide a theoretical basis for further study of the biological function of sorghum Shaker protein family.

Keywords：sorghum;Shaker family;bioinformatics analysis

鉀作為植物細(xì)胞內(nèi)主要的無機(jī)成分之一，占植株總干重的10%，在植物多種生命活動(dòng)中具有重要意義[1-4]。現(xiàn)有研究表明，鉀離子可以提高植物對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫的耐受性，同時(shí)也可以抵抗真菌等生物脅迫[5]。由于正常土壤中鉀離子的含量遠(yuǎn)低于植物細(xì)胞質(zhì)中含量[6]，植物的生長(zhǎng)需要根系從土壤溶液中吸收大量的鉀離子，并分布到整個(gè)植物中，以維持各個(gè)器官的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，植物鉀離子通道Shaker家族在這個(gè)過程中起到了至關(guān)重要的作用。

Shaker蛋白家族是通道蛋白中功能保守的一種，該蛋白家族廣泛存在于各種植物中[7-8]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的Shaker家族由9個(gè)成員組成[9-10]，根據(jù)其功能特點(diǎn)可劃分為5個(gè)亞組：內(nèi)向整流通道I（Inward Rectifying Channel I）：AKT1、AKT5、SPIK;內(nèi)向整流通道II（Inward Rectifying Channel II）：KAT1、KAT2;弱內(nèi)向整流通道（Weakly Inward Rectifying Channel）：AKT2;參與向內(nèi)整流電導(dǎo)形成的調(diào)節(jié)亞基（Regulatory Subunit Involved in Inwardly Rectifying Conductance Formation）：KC1（KAT3）;以及向外整流通道（Outward Rectifying Channel）：SKOR、GORK[11-13]。Shaker家族成員具有4個(gè)特殊的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是植物特異性的跨膜鉀離子通道結(jié)構(gòu)域：Ion_trans_2、存在于在離子通道與cNMP依賴性激酶中的結(jié)構(gòu)域：cNMP、含有多個(gè)重復(fù)短序列的結(jié)構(gòu)域：ANK以及富含疏水性和酸性殘基的鉀離子通道的二聚化結(jié)構(gòu)域：KHA[12]。正是因?yàn)檫@四種結(jié)構(gòu)域的相互協(xié)作，Shaker蛋白可以通道形成異源四聚體結(jié)構(gòu)[13]，可以使植物調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性[8]。在擬南芥中，9個(gè)鉀離子通道中有7個(gè)成員具有內(nèi)向整流特性，而外向整流通道僅有兩個(gè)成員，分別為：中柱外向整流型通道（SKOR）和保衛(wèi)細(xì)胞外向整流型鉀離子通道（GORK）[14]。同時(shí)，Shaker蛋白家族成員具有明顯的組織特異性;例如，擬南芥AtAKT1、AtKC1主要在植物根中表達(dá)[14-15]，而AtSPIK則主要在萌發(fā)的花粉管中表達(dá)，AtSKOR主要在擬南芥的根莖組織中表達(dá)，AtGORK主要在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[16]。

高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）具有喜溫、抗旱、耐貧瘠等優(yōu)良特點(diǎn)。在食用、藥用、釀酒以及飼料制作等方面有著重要意義，但其嚴(yán)重環(huán)境脅迫仍影響其生產(chǎn)[17-18]。高粱作為重要的經(jīng)濟(jì)作物及C4植物，對(duì)其開展Shaker通道的系統(tǒng)分析，對(duì)高粱及其他C4植物抗逆研究具有指導(dǎo)價(jià)值。然而，目前Shaker通道的系統(tǒng)分析局限于擬南芥、水稻（Oryza sativa）、紫花苜蓿（Medicago truncatula）等C3植物中，但包括高粱、小米在內(nèi)的C4植物中Shaker通道的系統(tǒng)分析尚且缺乏。本研究通過生物信息學(xué)的方法對(duì)高粱Shaker家族進(jìn)行了全基因組鑒定，染色體定位分析，基因結(jié)構(gòu)分析，系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，為進(jìn)一步探究高粱鉀離子通道Shaker蛋白家族提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 高粱Shaker蛋白家族成員的鑒定

擬南芥Shaker蛋白家族的序列來源于擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）。利用生物信息分析軟件TBtools 1.0的Simple HMM Search功能[19]。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥Shaker家族成員作為蛋白源序列建立的比對(duì)序列徽標(biāo)（PF00520、PF07885、PF00027、PF11834）檢索EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)，最終得到符合搜索條件的Shaker成員。然后利用在線網(wǎng)站SMART和NCBI-CD檢測(cè)所獲取序列的保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步篩選，最終獲得高粱Shaker蛋白家族全部成員。

1.2 高粱Shaker蛋白家族成員的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

用ExPASy-ProtParam Tool預(yù)測(cè)SbShakes的基本理化性質(zhì);根據(jù)Softberry（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線網(wǎng)站進(jìn)行SbShakers蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 高粱Shaker蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建以及亞族分組確定

利用CLUSTALW將擬南芥、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、水稻（Oryza sativa）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）以及高粱的Shaker蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。并通過鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）在MEGA 7.0中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值（Bootstrap）設(shè)定為1000[20]。并使用在線網(wǎng)站Evolview對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

二穗短柄草、水稻、馬鈴薯、玉米的Shaker基因家族的序列來源于EnsemblPlants（https：//plants.ensembl.org/）植物數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 高粱Shaker蛋白家族成員保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/）預(yù)測(cè)分析SbShakers蛋白保守功能基序，再結(jié)合TBtools對(duì)高粱Shaker家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

1.5 高粱Shaker蛋白家族成員染色體定位分析

利用生物信息分析軟件TBtools 1.0的Show Genes on Chromosome功能，對(duì)已經(jīng)鑒定的高粱中的SbShakers進(jìn)行染色體定位分析。

1.6 高粱Shaker蛋白家族成員共線性分析

利用TBtools 1.0軟件MCScanX功能對(duì)高粱Shaker成員進(jìn)行成員進(jìn)化的共線性分析，研究不同物種間Shaker家族成員的同源性。

1.7 高粱Shaker蛋白家族的組織及脅迫表達(dá)分析

通過在線網(wǎng)站高粱功能組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//structuralbiology.cau.edu.cn/sorghum/index.html）收集SbShakers成員的組織特異性以及環(huán)境脅迫處理表達(dá)數(shù)據(jù)，建立高粱Shaker蛋白家族表達(dá)熱圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱Shaker蛋白家族鑒定結(jié)果分析

運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域篩選驗(yàn)證后，從高粱全基因組中鑒定到9個(gè)Shaker家族成員，根據(jù)位于染色體位置順序依次命名為：SbShaker1～SbShaker9（表1）。

高粱Shaker家族的氨基酸序列長(zhǎng)度介于601 aa（SbShaker4）與919 aa（SbShaker1）之間;分子量介于65.80 kDa（SbShaker4）與100.65 kDa（SbShaker1）之間;等電點(diǎn)介于5.95（SbShaker9）和8.63（SbShaker3）之間;等電點(diǎn)在7左右，說明該家族可能是一類中性蛋白;在對(duì)Shaker家族進(jìn)行其亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該家族成員全部位于細(xì)胞質(zhì)膜上，這與Shaker家族通道蛋白的功能特點(diǎn)相符（表1）。應(yīng)用SMART 和NCBI-CD中分析結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)4個(gè)保守蛋白結(jié)構(gòu)域，它們分別為Ion_trans_2結(jié)構(gòu)域、cNMP結(jié)構(gòu)域、ANK結(jié)構(gòu)域和KHA結(jié)構(gòu)域。其中Shaker3、Shaker4、Shaker5不存在ANK結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)果與擬南芥Shaker家族成員中的AKT1、KAT3、KAT1相同。說明ANK結(jié)構(gòu)域在物種間遺傳中并不是非常保守，同時(shí)也說明了高粱與擬南芥Shaker蛋白家族結(jié)構(gòu)的相似性。

2.2 高粱Shaker蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高粱Shaker蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化情況，構(gòu)建高粱與擬南芥、二穗短柄草、水稻、馬鈴薯、玉米Shaker蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。其

中I亞族成員為：Sbshaker1、Sbshaker2，II亞族成員為：Sbshaker5，III亞族成員為：Shaker6、Shaker7、Shaker8，IV亞族成員為：Shaker3、Shaker4;Ⅴ亞族成員為：Shaker9。與擬南芥不同的是，在擬南芥Shaker蛋白家族中Ⅴ亞族成員有兩個(gè)，分別為SKOR和GORK。這兩個(gè)基因在擬南芥中作為向外整流通道而存在。因此可以推測(cè)出，高粱鉀離子通道中的外整流通道與擬南芥進(jìn)行了兩個(gè)不同的進(jìn)化歷程。除此之外，在I、II、IV亞族的成員個(gè)數(shù)也與擬南芥中亞族成員不一致。由此可見，高粱中Shaker通道的亞族成員在禾本科植物的不斷進(jìn)化中，可能發(fā)生了不保守遺傳。

2.3 高粱Shaker蛋白家族保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)高粱Shaker蛋白家族進(jìn)行了蛋白保守結(jié)構(gòu)基序分析，共預(yù)測(cè)到18個(gè)保守基序（Motif），同時(shí)對(duì)這些基序進(jìn)行注釋，結(jié)果顯示Motif 1、Motif 3對(duì)應(yīng)Ion_trans_2結(jié)構(gòu)域、Motif 2、Motif 5對(duì)應(yīng)cNMP結(jié)構(gòu)域，Motif 4、Motif 10對(duì)應(yīng)ANK結(jié)構(gòu)域，Motif 6、Motif 9對(duì)應(yīng)KHA結(jié)構(gòu)域;此外在I亞族中Shaker2的cNMP結(jié)構(gòu)域中多了Motif 8;III亞族中每一個(gè)成員的cNMP結(jié)構(gòu)域都多了Motif 15;IV亞族成員都不存在ANK結(jié)構(gòu)域;II亞族成員中Ion_trans_2結(jié)構(gòu)域中多了Motif 14;Ⅴ亞族中的KHA結(jié)構(gòu)域缺少M(fèi)otif 6。分析結(jié)果表明Shaker家族成員的結(jié)構(gòu)域并不是完全保守，高粱Shaker蛋白家族可能在物種進(jìn)化中發(fā)生某些功能的缺失和增加（圖2）。

對(duì)高粱Shaker蛋白家族結(jié)構(gòu)分析可知，9個(gè)成員中SbShaker4不含有非蛋白編碼區(qū)，全為蛋白編碼區(qū)段，剩余成員既含有編碼區(qū)段，又含非編碼區(qū)段。其中，SbShaker2、SbShaker5、SbShaker9均含有11個(gè)編碼區(qū);SbShaker6、SbShaker7含有6個(gè)編碼區(qū);SbShaker1含有9個(gè)編碼區(qū);SbShaker3含有7個(gè)編碼區(qū);SbShaker8含有8個(gè)編碼區(qū);與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致的是，聚集在同一亞族中的SbShakers成員，具有相同或相似外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和基因長(zhǎng)度（圖2）。這也表明了SbShakers基因結(jié)構(gòu)具有保守性。其次，Shaker家族基因結(jié)構(gòu)中其內(nèi)含子數(shù)目為0～10個(gè)，說明即使是相同亞類家族成員之間，其外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量也存在較大的差異（圖2）。

2.4 高粱Shaker蛋白家族染色體定位分析

通過生物信息學(xué)分析軟件TBtools對(duì)9個(gè)高粱Shakers家族基因進(jìn)行染色體定位分析。結(jié)果顯示：9個(gè)基因主要分布在2、3、4、9和10號(hào)染色體上;Shaker1分布在2號(hào)染色體上端，Shaker2、Shaker3處于3號(hào)染色體下端，Shaker4位于4號(hào)染色體上端，Shaker5位于4號(hào)染色體下端，Shaker10處于10號(hào)染色體上端。其中III亞族成員（Shaker6、Shaker7、Shaker8）全部位于9號(hào)染色體下端。而其他亞族成員不均等分布在其他染色體上?？深A(yù)測(cè)III亞族的成員（SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8）履行著相近或相同的生物學(xué)功能（圖3）。

2.5 高粱Shaker家族成員共線性分析

為深入研究不同物種間Shaker蛋白家族成員的同源性，利用模式植物：水稻，禾本科植物：二穗短柄草、高粱、玉米、谷子，繪制了5種Shaker基因家族共線圖（圖4）。共發(fā)現(xiàn)43對(duì)共線性基因。其中，每一個(gè)植物與另一物種的Shaker成員都出現(xiàn)了一個(gè)基因與多個(gè)基因或者多個(gè)基因與單個(gè)基因呈共線關(guān)系。可得出，在這些物種的進(jìn)化過程中發(fā)生了多個(gè)基因拷貝，其次通過對(duì)各個(gè)物種間的共線性傳遞的數(shù)量以及每個(gè)物種之間Shaker成員的數(shù)量可以分析出，高粱Shaker蛋白家族在禾本科的進(jìn)化歷程中相對(duì)保守。

2.6 高粱Shaker蛋白家族的組織及脅迫表達(dá)分析

對(duì)高粱Shaker蛋白家族9個(gè)成員在胚芽（Embryos）、花分生組織（Floral meristem）、花（Flowers）、營(yíng)養(yǎng)分生組織（Vegetative meristem）、根（Root）、葉（Shoot）6個(gè)部位進(jìn)行組織表達(dá)分析（圖5）。結(jié)果顯示，高粱在不同組織部位中的表達(dá)量差異顯著。I亞族成員：SbShaker1、SbShaker2表達(dá)差異較大，SbShaker1幾乎在上述部位中不表達(dá)，SbShaker2卻在除了花器官中的組織中都有表達(dá)，特別是在花分生組織表達(dá)量最高;II亞族成員：SbShaker4在芽、胚芽、花分生組織中少量表達(dá);III亞族成員：SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8在上述組織中表達(dá)差異較大。其中，SbShaker6在上述組織中均表達(dá)，而且在營(yíng)養(yǎng)分生組織、芽、花中的表達(dá)量最高;SbShaker7在花中少量表達(dá);SbShaker8在六個(gè)組織部位均不表達(dá)。IV亞族成員SbShaker3、SbShaker5在各組織中均表達(dá)，由此得出該亞族成員主要在成熟器官中表達(dá)。其中V亞族成員SbShaker9在根部、花中的表達(dá)量最高，這與擬南芥、水稻中報(bào)道的類似。

此外，對(duì)SbShakers進(jìn)行激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、聚乙二醇模擬干旱（Polyethylene Glycol，PEG）分析（圖6）。結(jié)果顯示，I亞族成員： SbShaker1、SbShaker2在高粱的根與葉中表達(dá)量有所不同。SbShaker1在脫落酸、聚乙二醇處理下基因表達(dá)量變化極不顯著，SbShaker2在脫落酸、聚乙二醇處理，在根中表達(dá)量下調(diào)，而在葉中表達(dá)出現(xiàn)少量上調(diào)趨勢(shì);II亞族成員：SbShaker5在高粱根中的表達(dá)，基本不受脫落酸與聚乙二醇的影響，但在葉中SbShaker5表達(dá)量卻顯著提高;III亞族成員：SbShaker7、SbShaker8在脫落酸與聚乙二醇處理，表達(dá)不顯著，但SbShaker6在脫落酸處理，其基因表達(dá)量顯著下調(diào)。IV亞族成員SbShaker3、SbShaker4在脫落酸與聚乙二醇處理表達(dá)也不明顯。V亞族成員SbShaker9的表達(dá)量則與環(huán)境中脫落酸與聚乙二醇呈正相關(guān)，且通過外源施加脫落酸還會(huì)導(dǎo)致SbShaker9的基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯的上升的趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

鉀是一種重要的礦質(zhì)元素，在植物體內(nèi)的各項(xiàng)生命活動(dòng)中都發(fā)揮重要作用，如膨脹度調(diào)節(jié)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔和葉片運(yùn)動(dòng)以及酶活性調(diào)節(jié)方面[1-3，21]。其中Shaker蛋白家族是一類維持植物體內(nèi)鉀離子穩(wěn)態(tài)的重要通道蛋白，該家族在植物體進(jìn)行環(huán)境抗逆方面發(fā)揮著極其重要的作用[22-24]。本研究對(duì)高粱Shaker蛋白家族進(jìn)行全基因組鑒定，并從進(jìn)化、基因表達(dá)等方面進(jìn)行系統(tǒng)分析。在高粱中共鑒定到9個(gè)成員，并按基因及蛋白結(jié)構(gòu)特征，分為5個(gè)亞家族（亞族I～亞族V）。前人的研究結(jié)果顯示，擬南芥和馬鈴薯（Solanum tuberosum）共有9個(gè)Shaker蛋白;水稻和甘薯（Ipomoea batatas）有11個(gè);梨（Pyrus × bretschneideri）有8個(gè)，說明高粱的Shaker家族成員在物種進(jìn)化過程中相對(duì)保守[25-28]。但與擬南芥、水稻的成員分布不同的是：高粱中鑒定到Shaker通道的III亞族中有3個(gè)（Shaker6、Shaker7、Shaker8），而在擬南芥中僅有1個(gè)（AtAKT2）;在V亞族中擬南芥有2個(gè)成員（AtGORK、AtSKOR），而高粱中僅有SbShaker9，該結(jié)果與豆科模式植物苜蓿（Medicago truncatula）類似[29-30]，說明不同的物種為了適應(yīng)不同環(huán)境，對(duì)Shaker通道進(jìn)行了基因拷貝或系統(tǒng)性缺失。

Shaker蛋白通道廣泛存于在植物的各個(gè)組織細(xì)胞中，具組織表達(dá)特異性[9-11]。AKT1是從吸收鉀離子缺陷酵母突變體功能互補(bǔ)中所克隆出的鉀離子通道基因，主要在擬南芥根中表達(dá)，它能響應(yīng)外界鉀離子濃度的變化來調(diào)節(jié)植物根中生長(zhǎng)所必需的鉀元素量，進(jìn)而影響生長(zhǎng)素在根中的重新分配[31-32]。SPIK是擬南芥中I亞族的成員，主要在花粉中特異性表達(dá)，它在維持花粉管的正常發(fā)育中起著重要作用[16]。高粱Shaker蛋白家族中I亞族成員中：SbShaker2在高粱的根中有表達(dá)，而且在胚芽、花的分生組織中的表達(dá)量最高。由此可預(yù)測(cè)高粱Shaker成員SbShaker2與擬南芥中AKT1蛋白可能具有類似的功能。KAT1是擬南芥中II亞族中的代表成員，主要表達(dá)在葉片保衛(wèi)細(xì)胞，在根和莖維管組織中也有少量表達(dá)[33]。本研究結(jié)果與該結(jié)論相似，從高粱鑒定到Shaker蛋白家族的II亞族成員SbShaker4，主要在花的分生組織中表達(dá)，在根中有少量表達(dá)。說明SbShaker4與擬南芥AKT1蛋白在功能方面，具有一定的相似性。AKT2是擬南芥中表達(dá)最具特點(diǎn)的成員，在整個(gè)植物韌皮部組織中都有表達(dá)，它是Shaker家族中唯一具有兩相激活動(dòng)力學(xué)的弱內(nèi)向整流功能特點(diǎn)的基因[17]。其中，環(huán)境中的pH值是植物中AKT2通道活性的強(qiáng)調(diào)節(jié)因子，外源pH會(huì)顯著下調(diào)AKT2的活性，即使是很小的細(xì)胞質(zhì)pH變化也會(huì)顯著影響AKT2的整流特性[34]。本研究中，在該亞族共鑒定到3個(gè)成員：SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8，根據(jù)基因表達(dá)以及同源分析可知，SbShaker6是AtAKT2在高粱中同源基因，由此預(yù)測(cè)SbShaker6具有與AKT2相似的功能特性。與之不同的，高粱中SbShaker7成員在高粱的花中有少量表達(dá)。AtKC1存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是異四聚體通道內(nèi)的調(diào)控亞基，能調(diào)控其他Shaker通道蛋白的表達(dá)，從而提高植物抗逆性[35-36]。在擬南芥中具有外向整流功能的Shaker家族成員有兩個(gè)，分別是SKOR和GORK。其中SKOR在擬南芥的根莖組織中表達(dá)，并將鉀離子運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部中;GORK在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，并通過保衛(wèi)細(xì)胞的鉀離子輸出，通道參與植物氣孔運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)植物蒸騰作用[37-38]。在高粱中鑒定唯一的外向整流通道SbSahekr9，在根與花中的表達(dá)量最高。

ABA、PEG能促進(jìn)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的鉀離子快速凈外排，從而誘導(dǎo)膨壓損失，從而介導(dǎo)氣孔關(guān)閉[39]。據(jù)報(bào)道，土壤中鹽離子的種類以及含量，對(duì)擬南芥中內(nèi)向整流AKT1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用不大，但植物為了維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，機(jī)體會(huì)引導(dǎo)KC1基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致AtKC1亞基通過形成異聚的AtKC1-AKT1通道的方式，來調(diào)節(jié)AKT1的表達(dá)量降低，減弱或阻隔對(duì)鉀離子的吸收，讓機(jī)體對(duì)鹽堿等脅迫產(chǎn)生抗性;但該異聚通道對(duì)外向整流通道成員的表達(dá)無影響[40]。與本研究類似，在高粱中利用植物逆境激素ABA對(duì)SbShaker3進(jìn)行處理，結(jié)果顯示SbShaker3的表達(dá)量增加，而I亞族成員SbShaker2的表達(dá)量顯著降低，但對(duì)SbShaker9無影響。由此可推測(cè)，在高粱鹽脅迫過程中仍然存在該結(jié)論。其次在擬南芥中進(jìn)行激素控制方面，AKT1對(duì)ABA、PEG處理不敏感[41]，而且外源施加脫落酸能迅速且強(qiáng)烈地抑制SKOR的表達(dá)[42];但ABA會(huì)誘導(dǎo)的AKT2、GORK表達(dá)上調(diào)，說明二者對(duì)植物抗干旱起重要作用[43]。在本研究中，對(duì)高粱Shaker家族進(jìn)行脅迫處理發(fā)現(xiàn)，對(duì)其施加脫落酸會(huì)對(duì)SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8、SbShaker9的表達(dá)量有明顯的提升。由此預(yù)測(cè)，SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8具有擬南芥中AKT1通道蛋白的相關(guān)功能;SbShaker9可能具有AtGORK相似的功能特點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法從高粱全基因組鑒定到9個(gè)高粱的Shaker蛋白家族成員，它們分布在高粱的2、3、4、9、10號(hào)染色體上。該家族成員有4個(gè)Shaker通道的特殊蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是Ion_trans_2、cNMP、ANK和KHA。SbShakers基因所編碼的蛋白序列長(zhǎng)度介于601 aa（SbShaker5）與919 aa（SbShaker1）之間，所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量介于65.80 kDa（SbShaker5）與100.65 kDa（SbShaker1）之間。其次，發(fā)現(xiàn)高粱中的Shaker通道具有組織表達(dá)特異性，而且部分成員對(duì)ABA、PEG的處理有明顯的影響。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究高粱中Shaker蛋白家族的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]? YI W，WU W.Regulation of potassium transport and signaling in plants [J].Current Opinion in Plant Biology，2017，39 （39）：123-128.

[2]? 魏永勝，梁宗鎖.鉀與提高作物抗旱性的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊，2001（6）：576-580.

[3]? ADAMS E，SHIN R.Transport，signaling，and homeostasis of potassium and sodium in plants [J].Journal of Integrative Plant Biology，2014，56（3）：231-249.

[4]? NIEVES-CORDONES M，AL SHIBLAWI F R，SENTENAC H.Roles and transport of sodium and potassium in plants [J].Metal Ions in Life Sciences，2016，16：291-324.

[5]? AMTMANN A，TROUFFLARD S，ARMENGAUD P.The effect of potassium nutrition on pest and disease resistance in plants [J].Physiologia Plantarum，2008，133（4）：682-691.

[6]? SCHROEDER J I，WARD J M，GASSMANN W.Perspectives on the physiology and structure of inward rectifying K channels in higher plants：biophysical implications for K uptake [J].Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，1994，23 （1）：441-471.

[7]? PILOT G，PRATELLI R，GAYMARD F，et al.Five-group distribution of the Shaker-like K+ channel family in higher plants [J].Journal of Molecular Evolution，2003，56（4）：418-434.

[8]? GAMBALE F，UOZUMI N.Properties of shaker-type potassium channels in higher plants [J].Journal of Membrane Biology，2006，210（1）：1-19.

[9]? ANNE L，ANNE-ALINOR V，HERV S.K+ channel activity in plants：Genes，regulations and functions [J].FEBS Letters，2007，581（12）：2357-2366.

[10] SHABALA S.Regulation of potassium transport in leaves：from molecular to tissue level.[J].Annals of Botany，2003，92（5）：627-634.

[11] SERGEY S.Regulation of potassium transport in leaves：from molecular to tissue level [J].Annals of Botany，2003，92（5）：627-634.

[12] BENOIT R.What can be deduced about the structure of Shaker from available data？ [J].Novartis Foundation Symposium，2002，245（P）：84-100

[13] DARAM P，URBACH S，GAYMARD F，et al.Tetramerization of the AKT1 plant potassium channel involves its C-terminal cytoplasmic domain[J].The EMBO Journal，1997，16（12），3455-3463.

[14] BIRGIT R，ALEXANDER S，NATALYA I，et al.AtKC1，a silent Arabidopsis potassium channel α-subunit modulates root hair K+ influx [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（6）：4079-4084.

[15] DENNISON K L，ROBERTSON W R，LEWIS B D，et al.Functions of AKT1 and AKT2 potassium channels determined by studies of single and double mutants of Arabidopsis [J].Plant Physiology，2001，127（3）：1012-1019.

[16] KARINE M，ANNE-ALINOR V，F(xiàn)RDRIC G，et al.Pollen tube development and competitive ability are impaired by disruption of a Shaker K+ channel in Arabidopsis [J].Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002，16（3）：339-350.

[17] 王偉仁.山西省高粱生產(chǎn)發(fā)展現(xiàn)狀與對(duì)策研究 [D].太古：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：12

[18] 季樹太，王佐民，郭書剛.釀酒高粱研究芻議 [J].釀酒，2019，46（2）：28-30.

[19] CHEN C，CHEN C，ZHANG Y，et al.TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J].Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[20] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for bigger datasets[J].Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[21] ZHANG A，REN H，TAN Y，et al.S-type anion channels SLAC1 and SLAH3 function as essential negative regulators of inward K+ channels and stomatal opening in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2016，28（4）：949-965.

[22] FUCHS I，F(xiàn)UCHS S，IVASHIKINA N，et al.Rice K+ uptake channel OsAKT1 is sensitive to salt stress [J].Planta，2005，221（2）：212-221.

[23] 周練. GmPIP1：6和GmAKT2基因在大豆抗逆中的功能研究 [D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

[24] OBATA T，KITAMOTO H K，NAKAMURA A，et al.Rice shaker potassium channel OsKAT1 confers tolerance to salinity stress on yeast and rice cells [J].Plant Physiology，2007，144（4）：1978-1985.

[25] NAGA-AMRUTHA R，NATARAJ-SEKHAR P，RAJEEV K，et al.Genome-wide analysis and identification of genes related to potassium transporter families in rice （Oryza sativa L.） [J].Plant Science，2006，172（4）：708-721.

[26] JIN R，ZHANG A，SUN J，et al.Identification of Shaker K+ channel family members in sweetpotato and functional exploration of IbAKT1 [J].Gene，2020，768：145311.

[27] CHEN G，CHEN Q，QI K，et al.Identification of Shaker K+ channel family members in rosaceae and a functional exploration of PbrKAT1 [J].Planta，2019，250（6）：1911-1925.

[28] 尹歡，卓鳳萍，鄧可宣，等.馬鈴薯Shaker基因家族全基因組鑒定和分析 [J].重慶科技學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，21（3）：104-108，116.

[29] HYUN Y K，EUN H C，MYUNG K M，et al.Differential gene expression of two outward-rectifying shaker-like potassium channels OsSKOR and OsGORK in rice [J].Journal of Plant Biology，2015，58（4）：230-235.

[30] ALICE D，JULIEN T，LIMIN W，et al.Functional characterization and physiological roles of the single Shaker outward K+ channel in Medicago truncatula [J].The Plant Journal，2020，102（6）：1249-1265.

[31] SENTENAC H，BONNEAUD N，MINET M，et al.Cloning and expression in yeast of a plant potassium ion transport system [J].Science，1992，256（5057）：663-665.

[32] LI J，WU W，WU Y.Potassium channel AKT1 is involved in the auxin-mediated root growth inhibition in Arabidopsis response to low K+ stress [J].Journal of Integrative Plant Biology，2017，59（12）：895-909.

[33] PILOT G，LACOMBE B，GAYMARD F，et al.Guard cell inward K+ channel activity in Arabidopsis involves expression of the twin channel subunits KAT1 and KAT2 [J].Journal of Biological Chemistry，2001，276（5）：3215-3221.

[34] LACOMBE B，PILOT G，MICHARD E，et al.A shaker-like K+ channel with weak rectification is expressed in both source and sink phloem tissues of Arabidopsis [J].The Plant Cell，2000，12（6）：837-851.

[35] DUBY G，HOSY ERIC，F(xiàn)IZAMES C，et al.AtKC1，a conditionally targeted Shaker-type subunit，regulates the activity of plant K+ channels [J].The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2008，53（1）：115-123.

[36] WANG Y，H L，LI H，XU，et al.Potassium channel α-subunit AtKC1 negatively regulates AKT1-mediated K+ uptake in Arabidopsis roots under low-K+ stress[J].Cell Research，2010，20（7）：826-837.

[37] ANDERSON J A，HUPRIKAR S S，KOCHIAN L V，et al.Functional expression of a probable Arabidopsis thaliana potassium channel in Saccharomyces cerevisiae [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（6）：4079-4084.

[38] NIEVES-CORDONES M，ALEMN F，MARTNEZ V，et al.K+ uptake in plant roots.The systems involved，their regulation and parallels in other organisms [J].Journal of Plant Physiology，2014，171（9）：688-695.

[39] JULIAN I S，KLAUS R，ERWIN N.Voltage dependence of K+ channels in guard-cell protoplasts [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1987，84（12）：4108-4112.

[40] PONGS O.Molecular biology of voltage-dependent potassium channels [J].Physiological Reviews，1992，72（4）：S69-S88.

[41] JEANGUENIN L，ALCON C，DUBY G，et al.AtKC1 is a general modulator of Arabidopsis inward Shaker channel activity[J].The Plant Journal，2011，67（4）：570-582.

[42] GAYMARD F，PILOT G，LACOMBE B，et al.Identification and disruption of a plant Shaker-like outward channel involved in K+ release into the xylem sap [J].Cell，1998，94（5），647-655.

[43] CUIN T A，DREYER I，MICHARD E.The role of potassium channels in Arabidopsis thaliana long distance electrical signalling：AKT2 modulates tissue excitability while GORK shapes action potentials [J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（4）：926.

通訊作者：謝鑫（1984—），男，博士，副教授，主要從事植物抗病基因功能研究，E-mail：xiexin2097757@163.com.