Ag摻雜HA粉體及陶瓷材料的制備和抗菌性能研究

李曉爽，于景媛，李 強(qiáng)

Ag摻雜HA粉體及陶瓷材料的制備和抗菌性能研究

李曉爽，于景媛，李 強(qiáng)

（遼寧工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

利用水熱法合成載銀羥基磷灰石抗菌粉體，并通過高溫?zé)Y(jié)法制備載銀羥基磷灰石陶瓷材料。以大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，通過測(cè)量抑菌圈、最小抑菌濃度(MIC)和殺菌率的方法來測(cè)定載銀羥基磷灰石粉體和陶瓷材料的抗菌性能。研究結(jié)果表明Ag+取代Ca2+在HA晶體中的位置，生成AgCa10-x(PO4)6(OH)2，使衍射峰發(fā)生了偏移?？咕詫?shí)驗(yàn)表明隨著Ag+摻入量的增加，抑菌圈直徑增大但是抗菌劑最小抑菌濃度降低，殺菌率結(jié)果表明載銀羥基磷灰石粉體和燒結(jié)后陶瓷塊體對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抗菌性且具有一定的抗菌持久性，其中載銀羥基磷灰石塊體材料的抗菌效果更佳。

納米載銀羥基磷灰石粉體；載銀羥基磷灰石陶瓷；水熱法；抗菌性

HA材料由于具有與人體硬組織（如骨骼、牙齒等）的無機(jī)成分相似的結(jié)構(gòu)和組成，以及良好的生物相容性、生物活性而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如骨填充材料或非受力部位的植入體等[1-2]，但是羥基磷灰石容易吸附蛋白質(zhì)、氨基酸和其他有機(jī)質(zhì)，這導(dǎo)致細(xì)菌容易在HA植入物材料表面滋生[3-4]。研究表明在由生物材料引發(fā)的感染中，45%是細(xì)菌黏附在材料表面從而破壞材料結(jié)構(gòu)造成的[5]。為解決這一問題，常在材料中引入抗生素，但抗生素易被體液迅速?zèng)_洗而不能長(zhǎng)期保護(hù)材料，而且微生物在抗生素長(zhǎng)期作用下可能因基因突變產(chǎn)生耐藥性[6]。Ag＋對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒都具有良好的廣譜抗菌能力[7]。研究表明雖然Ag+對(duì)微生物的毒性強(qiáng)，但對(duì)人體細(xì)胞相對(duì)安全。近些年，載銀羥基磷灰石抗菌粉體（Ag-HA）逐漸成為抗菌材料的研究熱點(diǎn)。本工作結(jié)合了Ag＋的廣譜、高效抗菌性及HA的生物活性、相容性兩者的優(yōu)點(diǎn)，采用水熱法一步合成Ag-HA粉體，并通過高溫?zé)Y(jié)制備Ag-HA陶瓷材料，這種抗菌材料具有安全性高，不易揮發(fā)，不易分解，耐熱性好，對(duì)人體無害且能長(zhǎng)效抗菌、防霉等特點(diǎn)，是一種具有環(huán)保性質(zhì)的功能性新材料。本文通過XRD和SEM等手段對(duì)粉體進(jìn)行表征。以大腸桿菌和金黃葡萄球菌為研究對(duì)象，通過測(cè)量抑菌圈、最小抑菌濃度(MIC)和殺菌率的方法來測(cè)定Ag-HA粉體以及陶瓷的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

硝酸鈣（Ca(NO3)2）、硝酸銀（AgNO3）、磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)、十二烷基苯磺酸鈉、氨水(NH3·H2O)、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉(NaCl)、瓊脂粉、大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。

1.2 水熱法合成Ag-HA粉體

配置濃度為0.167 mol/L的AgNO3、Ca(NO3)2·4H2O溶液和濃度為0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)量將不同體積的AgNO3溶液加入到Ca(NO3)2溶液中，使得載Ag量分別為0.5 mol%（0.5 Ag-HA）、1.0 mol%（1.0 Ag-HA）和2 mol%Ag（2.0 Ag-HA），然后加入0.1 g十二烷基苯磺酸鈉，磁力攪拌15 min后再滴入0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液攪拌30 min后，加入氨水調(diào)節(jié)混合溶液pH=10~11。將混合液裝入反應(yīng)釜中，放入烘箱內(nèi)180 ℃下保溫6 h，進(jìn)行水熱反應(yīng)。待其冷卻至室溫后靜置24 h后將溶液離心，并用乙醇和離子水進(jìn)行多次洗滌，然后在80 ℃下干燥6 h，制備載Ag量不同的Ag-HA粉體。

1.3 Ag-HA陶瓷燒結(jié)

將載Ag-HA粉體在80 MPa下壓制成型，樣品尺寸為15 mm×4 mm，生坯室溫干燥24 h后，在管式爐中燒結(jié)成型，燒結(jié)溫度為1 150 ℃，升溫速率3 ℃ /min，保溫時(shí)間2 h，隨爐冷卻至室溫。

1.4 抑菌圈測(cè)試

將無菌的固體培養(yǎng)基加熱后倒入裝有200 μL的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，等待培養(yǎng)基凝固。將牛津杯均勻分布在凝固的培養(yǎng)皿上，用移液槍取150 μL不同載銀量的 Ag-HA懸濁液放入牛津杯中，蓋上陶土蓋放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，同理將不同載銀量的 Ag-HA塊體均勻分布在凝固的培養(yǎng)皿上，也放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量牛津杯和圓塊周圍的抑菌圈直徑。

1.5 最小抑菌濃度測(cè)試

將不同載銀量的Ag-HA粉體制成濃度為4 800 μg/mL的懸濁液，將試管中的懸濁液用2倍稀釋法將濃度依次稀釋并獲得濃度為4 800、2 400、1 200、600、300、150、75、37.5、18.75 μg/mL的抗菌懸濁液，一組不加抗菌劑作為空白對(duì)照，向每個(gè)試管中加入100 μL濃度為105 cfu/mL的菌液，放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)試管中分別移取100 μL懸濁液涂平板，倒置平板培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，確定最小抑菌濃度。

1.6 殺菌率測(cè)試

向裝有10 mL的液體培養(yǎng)基試管中放入100 μL濃度為105 cfu/mL的菌液，將不同載銀量的 Ag-HA粉體放入濃度為105 cfu/mL菌懸液中，使其均勻分布在菌懸液中。分別在1、5、9、18 h和24 h以后移取100 μL菌液進(jìn)行10倍的稀釋涂平板，將平板倒置培養(yǎng)24 h觀察平板上的細(xì)菌數(shù)目得出殺菌率，塊體同上。殺菌率計(jì)算公式為：

式中：為殺菌率，為對(duì)照組細(xì)菌數(shù)，為實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 Ag摻雜納米HA粉體的物相組成分析

圖1是180 ℃下合成的不同載Ag量的納米HA粉體的XRD圖譜。表1為不同載Ag量的納米HA粉體在（002）晶面的XRD參數(shù)分析。從圖1和表1中可知，在180 ℃下水熱合成的不同載Ag量的納米HA粉體有尖銳的衍射峰且有相同的峰形。說明水熱合成的Ag-HA晶體具有良好的發(fā)育和較高的結(jié)晶程度。在XRD圖中未檢測(cè)到新相，這說明所制備的粉體主要由HA相組成。與純HA衍射峰25.992°比較，所有Ag-HA的晶面衍射峰位向小角度方向偏移，其原因可能是由于Ag+半徑大于Ca2+半徑，Ag+摻雜后引起HA晶格畸變，導(dǎo)致面間距變小，根據(jù)布拉格方程=2sin，當(dāng)X射線的波長(zhǎng)不變的時(shí)候，變大則會(huì)變小，從而造成了衍射角向小角度偏移。因此Ag摻雜HA粉體后，Ag+將HA晶體中Ca2+的位置替代生成了Ca10-xAg(PO4)6(OH)2離子固溶體。

圖1 不同載銀量Ag-HA粉體的XRD圖譜

表1 不同Ag摻雜的HA粉體的XRD參數(shù)分析

2.2 Ag摻雜納米HA粉體的微觀形貌分析

圖2是不同Ag摻雜HA粉體的微觀形貌照片。在圖2中可以看到水熱法180 ℃時(shí)，Ag-HA結(jié)晶度高，長(zhǎng)度在200~300 nm，直徑在20~40 nm，有較高長(zhǎng)徑比。在Ag原子分?jǐn)?shù)為2%，長(zhǎng)徑比最為明顯。分析其原因如下：HA 在結(jié)晶結(jié)構(gòu)上存在平行于c軸的通道，在HA中引入Ag+后，Ag+沿c軸進(jìn)入晶胞取代Ca2+位置, 由于Ag+（0.115 nm）半徑比 Ca2+（0.106 nm）半徑略大，前者和后者可以完成1∶1的替代，由于二者價(jià)態(tài)上的差異，所以結(jié)構(gòu)中存在未飽和的電場(chǎng)力，導(dǎo)致晶體生長(zhǎng)變形。當(dāng) Ag+取代 Ca2+時(shí)，沿 c軸方向的微晶尺寸的增加幅度較大，而沿 a 軸方向的微晶尺寸基本不變；故當(dāng)Ag摻入量增大時(shí)，HA晶體是沿晶軸方向生長(zhǎng)的，細(xì)棒狀晶粒的長(zhǎng)度增加。

圖2(e)是2%Ag-HA粉體的EDS分析譜圖。在圖2(e)中可以看到Ag元素的峰值，這說明Ag確實(shí)摻雜進(jìn)HA粉體中。（其中Na和Si元素來源于分散HA粉體時(shí)水溶液的污染）。由EDS分析計(jì)算出Ca和P的百分含量，其中Ca/P比等于1.63，而純HA中Ca/P比等于1.67，這說明部分Ca2+離子的含量被Ag+離子所取代。

(a)HA；(b)0.5% Ag-HA；(c)1% Ag-HA；(d)2% Ag-HA；(e)2% Ag-HA粉體的EDS分析譜圖

2.3 Ag-HA粉體的抗菌性能分析

圖3中1組和2組分別為不同載Ag量Ag-HA粉體在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)24 h效果圖，表2表示了不同載Ag量Ag-HA粉體的大腸桿菌/金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑(mm)。

(a) HA; (b)0.5% Ag-HA; (c)1% Ag-HA; (d)2% Ag-HA

表2 不同載銀量Ag-HA的大腸桿菌/金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑 (mm)

由圖3和表2可知，純HA牛津杯周圍長(zhǎng)滿了細(xì)菌，說明純HA對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌基本無抑菌作用，隨著銀離子的摻入，牛津杯周圍沒有菌落生長(zhǎng)，開始出現(xiàn)明顯的抑菌圈，隨著載銀量的增加，抑菌圈直徑也隨之增加，因此載銀HA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制效果。此外，又培養(yǎng)3 d，抑菌圈直徑無明顯變化，牛津杯周圍沒有細(xì)菌生長(zhǎng)，這表明Ag-HA具有一定的抗菌穩(wěn)定性。

為了進(jìn)一步考察不同載銀量的HA粉體的抗菌效果，測(cè)定了不同載銀量HA粉體的最小抑菌濃度（MIC值）。圖4是0.5% Ag-HA粉體對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度圖。由圖4可知，當(dāng)添加Ag-HA懸濁液濃度為4 800 μg/mL至150 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)皿中并無細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌全部被Ag+殺掉，當(dāng)濃度為 75 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)皿中開始出現(xiàn)少量細(xì)菌，大部分細(xì)菌被Ag+殺掉，隨著Ag-HA懸濁液濃度逐漸降低，培養(yǎng)皿中細(xì)菌的數(shù)量開始不斷增多，(j)為本實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組，未加Ag-HA懸濁液，因此培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿了細(xì)菌。所以0.5% Ag-HA的最小抑菌濃度為150 μg/mL。實(shí)驗(yàn)測(cè)得0.5%、1%、2% Ag-HA對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度依次為300、150、75 μg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度依次為150、75、37.5 μg/mL，數(shù)值都低于800 μg/mL，且隨著載銀量的增加，最小抑菌濃度值逐漸降低。

(a)4 800 μg/mL; (b)2 400 μg/mL; (c)1 200 μg/mL; (d)600 μg/mL; (e)300 μg/mL; (f)150 μg/mL; (g)75 μg/mL; (h)37.5 μg/mL; (i)18.75 μg/mL; (j)空白對(duì)照

圖5中1組和2組分別是0.5% Ag-HA、HA粉體在大腸桿菌中培養(yǎng)不同時(shí)間的殺菌率。圖6中1組和2組分別是0.5% Ag-HA、HA在金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)不同時(shí)間的殺菌率。

由圖5、6可知，0.5%Ag-HA粉體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的殺菌作用。0.5% Ag-HA粉體在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)1h時(shí)殺菌率就可達(dá)到99.9%、98%。作用5 h后，可以看到培養(yǎng)皿中完全沒有細(xì)菌生成，對(duì)兩種細(xì)菌的殺菌率可達(dá)到100%。而純HA在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中作用1 h時(shí)，細(xì)菌便長(zhǎng)滿了整個(gè)培養(yǎng)皿，所以其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌幾乎無抗菌作用。1% Ag-HA和2% Ag-HA對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在1 h的殺菌率就可達(dá)到100%，說明抗菌劑載銀量越大，其殺菌效果越好。

(a)1 h; (b)5 h; (c)9 h; (d)18 h; (e)24 h;

(a)1 h; (b)5 h; (c)9 h; (d)18 h; (e)24 h

圖7為Ag-HA粉體的抗菌模型，其抗菌原理可能是因?yàn)椋捍竽c桿菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖和脂多糖組成，Ag+可能通過阻礙聚糖鏈、短肽，肽橋的形成，使肽聚糖不能正常合成，破壞了細(xì)胞壁，使細(xì)菌生長(zhǎng)受阻。此外，Ag+穿過細(xì)胞壁，與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞膜蛋白質(zhì)主要是以內(nèi)在蛋白和外在蛋白兩種形式同膜脂質(zhì)相結(jié)合的，Ag+能夠與內(nèi)在蛋白中的疏水羥基結(jié)合使細(xì)胞膜蛋白質(zhì)受損，破壞了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性和生化反應(yīng)的有序進(jìn)行。同時(shí)Ag+與細(xì)胞內(nèi)部蛋白酶的巰基結(jié)合，使蛋白酶失去活性，使細(xì)菌細(xì)胞致死。同時(shí)也會(huì)干擾DNA分子的復(fù)制，阻礙細(xì)菌繁殖。

圖7 Ag-HA抗菌模型

2.4 Ag-HA陶瓷材料的抗菌性能分析

圖8是純HA、1% Ag-HA、2% Ag-HA塊體在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)24 h效果圖，表3是其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑（mm）。由圖8和表3可知，純HA圓塊周圍長(zhǎng)滿了細(xì)菌，基本無抑菌效果。1% Ag-HA、2% Ag-HA塊體周圍細(xì)菌被殺死出現(xiàn)明顯的抑菌圈。1% Ag-HA、2% Ag-HA塊體對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為15.9 mm和18.5 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16.2 mm和19.1 mm，均大于同載Ag量的Ag-HA粉體對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌圈直徑。這說明相對(duì)于Ag-HA粉體，Ag-HA塊體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果更好。這可能是因?yàn)锳g-HA粉體所制備的懸浮液中釋放出的Ag+離子濃度相對(duì)于Ag-HA塊體釋放出的Ag+離子濃度小，而Ag+離子濃度越大，抑菌效果越好，所以本實(shí)驗(yàn)中塊體Ag-HA材料比粉體的抑菌效果更好。

(A1) HA; (B1)1% Ag-HA; (C1)2% Ag-HA(A2) HA; (B2)1% Ag-HA; (C2)2% Ag-HA

表3 不同載銀量Ag-HA塊體的大腸桿菌/金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑 (mm)

(a)HA; (b) 1% Ag-HA

圖9是HA、1% Ag-HA圓塊在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)1h的殺菌率圖。由圖可知，純HA圓塊在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中作用1 h時(shí)，整個(gè)培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿了細(xì)菌，所以純HA圓塊對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌并無明顯的殺菌作用。1% Ag-HA圓塊在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)1 h時(shí)殺菌率就可達(dá)到100%。作用5、9、18、24 h后，培養(yǎng)皿中仍沒有長(zhǎng)出細(xì)菌，殺菌率依然為100%。2% Ag-HA圓塊在兩種細(xì)菌中作用1、5、9、18、24 h后殺菌率可達(dá)到100%。因此Ag-HA圓塊對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有良好的殺菌效果。

3 結(jié)論

（1）XRD分析表明Ag+的摻雜使HA的（002）衍射峰向小角度進(jìn)行了偏移，這說明Ag+的摻雜部分取代了HA中Ca2+的位置。SEM觀察表明Ag+摻雜的HA粉體呈現(xiàn)細(xì)棒狀，在Ag含量為2 at%，長(zhǎng)徑比最為明顯。

（2）抗菌性實(shí)驗(yàn)表明：在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中，隨Ag+摻入量的增加，Ag-HA粉體抑菌圈直徑增大，在2% Ag-HA時(shí)抑菌圈直徑分別達(dá)到最大值18.5 mm和19.1 mm，最小抑菌濃度逐漸降低到37.5 μg/mL。Ag-HA塊體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑比粉體大。

（3）Ag-HA粉體和塊體對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的殺菌作用和抗菌持久性，殺菌率可達(dá)到100%。純HA粉體和塊體對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)幾乎無抑制作用。

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Study on Preparation and Antibacterial Properties of Silver-loaded Lydroxyapatite Powder and Silver-Loaded Hydroxyapatite Ceramic

LI Xiao-shuang, YU Jing-yuan, LI Qiang

（School of Materials Science and Engineering, Liaoning University of Technology, Jinzhou 121001, China）

Silver-loaded hydroxyapatite antibacterial powder (Ag-HA) was synthesized by Hydrothermal method. The E.coli and Staphylococcus aureus were used as the research objects, and the antibacterial properties of the silver-loaded hydroxyapatite antibacterial agents were determined by the inhibition zone and the minimum inhibitory concentration (MIC) and bactericidal rate. The results show that Ag+substitutes for the position of Ca2+in the HA crystal produce AgCa10-x(PO4)6(OH)2in hydrothermal conditions, and the XRD peaks shift. The antiseptic experimental results show that the diameter of the inhibition zone increases and the MIC of the antibacterial agent decreases with the increase of the Ag+contents for the Ag-HA powder and Ag-HA ceramic samples. The results of the sterilization rate show that Ag-HA powder and ceramic samples have a good effect on the E.coli and Staphylococcus aureus and certain antibacterial persistence. The antibacterial activity of Ag-HA ceramic was better than that of Ag-HA powder.

silver doped nano-hydroxyapatite powder; silver doped nano-hydroxyapatite ceramic; hydrothermal method; antibacterial property

TB34

A

1674-3261(2021)01-0038-05

10.15916/j.issn1674-3261.2021.01.009

2020-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51805236），遼寧省教育廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（JJL201915407）

李曉爽(1996-)，女，遼寧大連人，碩士生。

于景媛(1979-)，女，遼寧鐵嶺人，教授，博士。

責(zé)任編校：劉亞兵