謝守嬪，顏偉姍，王 瑛，周迎霞，彭小蘭，李海龍

甘肅省蘭州市第一人民醫(yī)院：1.神經(jīng)科；2.感染管理科，甘肅蘭州 730050；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院放射影像科，甘肅蘭州 730030；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000

膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)。有研究表明，ANXA2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，且其表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，是膠質(zhì)瘤獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[1-4]。據(jù)報(bào)道，沉默ANXA2可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87的增殖，相反，上調(diào)ANXA2的表達(dá)可以促進(jìn)U251細(xì)胞增殖[4]。沉默ANXA2可抑制信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G1～S期[5]。研究表明，ANXA2參與惡性膠質(zhì)瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。ANXA2的泛素化和降解，S100鈣結(jié)合蛋白A11(S100A11)與ANXA2相互作用，參與調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路。此外，NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平上正向調(diào)節(jié)S100A11，證明了S100A11在神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的作用。為進(jìn)一步明確ANXA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及參與膠質(zhì)瘤惡性表型形成的機(jī)制，本研究擬借助于生物信息學(xué)軟件，分析ANXA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、預(yù)后及其相關(guān)信號(hào)通路的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤及癌旁組織中的表達(dá)分析 選擇基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析軟件開(kāi)展ANXA2在膠質(zhì)瘤及癌旁組織的表達(dá)分析，這些在線軟件包括：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，ONCOMINE(https://www.oncomine.org/resource/login.html)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)。

1.2ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤組織異常表達(dá)的生存分析 利用在線分析網(wǎng)站Human protein atlas(https://www.proteinatlas.org/)對(duì)ANXA2基因分別在高表達(dá)和低表達(dá)膠質(zhì)瘤患者中的臨床樣本進(jìn)行無(wú)病生存期和總生存期分析。

1.3與ANXA2基因有相關(guān)性的基因信號(hào)通路富集分析 使用UALCAN軟件檢索與ANXA2基因有相關(guān)性的基因，其中表達(dá)上調(diào)的相關(guān)基因的相關(guān)系數(shù)(r)在0.30～0.99，表達(dá)下調(diào)的相關(guān)基因的r在-0.61～-0.30，并分別將上調(diào)和下調(diào)的基因全部輸入DAVID 6.8軟件(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)信號(hào)通路富集分析。

1.4與ANXA2有相關(guān)性的腫瘤基因蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 選擇在線STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，將34個(gè)與ANXA2有相關(guān)性的腫瘤基因輸入在線軟件STRING進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。并觀察節(jié)點(diǎn)，尋找節(jié)點(diǎn)最多的關(guān)鍵基因。

1.5與腫瘤有相關(guān)性的通路基因的表達(dá)情況及生存期分析 分析1.3中相關(guān)基因富集的信號(hào)通路，選擇與腫瘤有相關(guān)性的信號(hào)通路，以及關(guān)鍵基因，利用GEPIA在線軟件分析這些關(guān)鍵基因的表達(dá)對(duì)生存期的影響。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 富集分析結(jié)果的差異比較采用Fisher檢驗(yàn)；PPI網(wǎng)絡(luò)分析采用K-means聚類算法，以n=3進(jìn)行聚類分析；生存分析方法采用Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤及癌旁組織中的表達(dá) 檢索3個(gè)生物信息學(xué)分析軟件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的結(jié)果表明，與癌旁組織比較，ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：A為UALCAN生物信息學(xué)分析軟件基因相對(duì)表達(dá)水平；B為GEPIA生物信息學(xué)分析軟件基因相對(duì)表達(dá)水平；C為ONCOMINE生物信息學(xué)分析軟件作者SUN提供的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；D為ONCOMINE生物信息學(xué)分析軟件作者SHAI提供的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2.2ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤及癌旁組織中的生存分析 采用Human protein atlas分析預(yù)后生存期顯示，與ANXA2基因低表達(dá)組比較，膠質(zhì)瘤中ANXA2基因高表達(dá)組生存期縮短，預(yù)后相對(duì)較差(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3與ANXA2基因有相關(guān)性的基因的信號(hào)通路富集分析 通過(guò)UALCAN和DAVID 6.8軟件分析發(fā)現(xiàn)，與ANXA2基因有相關(guān)性的上調(diào)基因共有1 396個(gè)，富集在35個(gè)信號(hào)通路中，其中與腫瘤有相關(guān)性的有10個(gè)，分別是Wnt信號(hào)通路、結(jié)直腸癌、cAMP信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、細(xì)胞周期、ErbB信號(hào)通路、子宮內(nèi)膜癌、慢性粒細(xì)胞白血病、癌癥中的膽堿代謝、mTOR信號(hào)通路；與ANXA2基因有相關(guān)性的下調(diào)基因共有1 152個(gè)，富集在59個(gè)信號(hào)通路中，其中與腫瘤有相關(guān)性的有11個(gè)，分別是細(xì)胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、局灶性粘連、細(xì)胞外受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞凋亡、Jak-STAT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，以上分析以富集倍數(shù)大于2的信號(hào)通路為篩選標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1、2。

圖2 ANXA2基因在人膠質(zhì)瘤及癌旁組織中的生存分析

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 篩選出與腫瘤有相關(guān)性的信號(hào)通路，再將34個(gè)基因富集在與腫瘤有相關(guān)性的信號(hào)通路中，進(jìn)行PPI分析，并將其聚類在3個(gè)模塊中。分析其節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是節(jié)點(diǎn)最多的基因，由此提示，這5個(gè)基因在ANXA2基因調(diào)控膠質(zhì)瘤的生物表型中發(fā)揮重要作用。

2.5與腫瘤有相關(guān)性的通路基因的表達(dá)情況及生存期分析 相關(guān)基因表達(dá)分析顯示，與ANXA2表達(dá)有相關(guān)性的34個(gè)基因均為腫瘤組織中高表達(dá)的癌基因(P<0.05)?？偵嫫诜治鲲@示，THBS1、RRAS、OSMR、IL13RA1、COL6A1、PLAUR、SOCS3、ITGB5、TNFRSF1A、ITGA5、IQGAP1、HSPB1共12個(gè)基因的表達(dá)與總生存期相關(guān)(P<0.05)。無(wú)病生存期分析顯示，TNFRSF12A、TGFB1、OSMR、LIF、ITGA5、ITGB5、TNC、THBS1、CACNA2D4、IL13RA1、COL6A1、CD276、ITGA3、CCL2、SOCS3共15個(gè)基因的表達(dá)與無(wú)病生存期相關(guān)(P<0.05)。其中，THBS1、OSMR、ITGA5、ITGB5、SOCS3、COL6A1、IL13RA1共7個(gè)基因的總生存期和無(wú)病生存期分析結(jié)果均顯示，其基因的異常表達(dá)與預(yù)后關(guān)系密切。綜合相關(guān)基因表達(dá)預(yù)后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1和ITGB5均為與預(yù)后有相關(guān)性的基因。見(jiàn)表3。

表1 與ANXA2基因有相關(guān)性的上調(diào)基因富集的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路

表2 與ANXA2基因有相關(guān)性的下調(diào)基因富集的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路

表3 與腫瘤有相關(guān)性的通路基因的表達(dá)情況及生存期分析

3 討 論

膠質(zhì)瘤約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%，世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)屬于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)屬于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，其惡性程度越來(lái)越高。每個(gè)等級(jí)的臨床治療和預(yù)后不同；但絕大部分膠質(zhì)瘤是Ⅲ級(jí)的間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤和Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，基本無(wú)法治愈[8-9]。近年來(lái)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究趨向于基因治療學(xué)及分子生物學(xué)，發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞因子的表達(dá)能通過(guò)下游相關(guān)信號(hào)通路的變化，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性演變，加速或延緩病情的進(jìn)展。因此，針對(duì)不同通路的靶向治療也成了研究熱點(diǎn)，隨著研究的深入，從分子水平調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展成為可能。

本研究基于生物信息學(xué)分析軟件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的結(jié)果均顯示，ANXA2基因在膠質(zhì)瘤中是明顯高表達(dá)的癌基因。與ANXA2基因有相關(guān)性的上調(diào)基因共有1 396個(gè)，富集在35個(gè)信號(hào)通路中，其中與腫瘤有相關(guān)性的有10個(gè)；與ANXA2基因有相關(guān)性的下調(diào)基因共有1 152個(gè)，富集在59個(gè)信號(hào)通路中，其中與腫瘤有相關(guān)性的有11個(gè)。ANXA2基因參與了細(xì)胞周期調(diào)控，這與鄧正海等[5]的研究，在U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中沉默ANXA2基因的表達(dá)，可以抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G1～S期的結(jié)果一致。ANXA2基因參與NF-κB信號(hào)通路，這與文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道的ANXA2基因參與NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的惡性膠質(zhì)瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的結(jié)果一致。因此，借助于生物信息學(xué)軟件，明顯有助于開(kāi)展腫瘤標(biāo)志物的表型和機(jī)制研究，能避免機(jī)制研究的盲目性。

PPI分析發(fā)現(xiàn)TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是節(jié)點(diǎn)最多的基因，這5個(gè)基因在ANXA2基因調(diào)控膠質(zhì)瘤的生物表型中發(fā)揮重要作用，而且，綜合相關(guān)基因表達(dá)預(yù)后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5均為與預(yù)后有相關(guān)性的基因。這一結(jié)果為后期深入探討分子機(jī)制，提供了思路和研究切入點(diǎn)。

使用Human protein atlas分析預(yù)后生存期顯示，與ANXA2基因低表達(dá)組比較，ANXA2基因高表達(dá)組生存期縮短，預(yù)后相對(duì)較差。與腫瘤有相關(guān)性的信號(hào)通路的34個(gè)基因中，12個(gè)基因的表達(dá)與總生存期相關(guān)；15個(gè)基因的表達(dá)與無(wú)病生存期相關(guān)。ANXA2基因可能是膠質(zhì)瘤中潛在的癌基因，與腫瘤有相關(guān)性并富集在20個(gè)信號(hào)通路中的基因的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后明顯相關(guān)。因此，ANXA2基因表達(dá)上調(diào)在膠質(zhì)瘤中的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并有望成為判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的重要的腫瘤標(biāo)志物。

近年來(lái)，采用生物信息學(xué)的方法，開(kāi)展驅(qū)動(dòng)基因、腫瘤標(biāo)志物和信號(hào)通路的篩選，以及分子機(jī)制的研究，受到越來(lái)越多的關(guān)注，也越來(lái)越被學(xué)術(shù)界認(rèn)可[10-15]，本研究主要從ANXA2基因表達(dá)水平改變、預(yù)后分析、參與的信號(hào)通路分析，以及高度相關(guān)基因的預(yù)后生存分析入手，對(duì)其基因的功能表型及調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展的分子機(jī)制進(jìn)行了生物信息學(xué)的研究和分析，結(jié)果對(duì)深入開(kāi)展該基因調(diào)控膠質(zhì)瘤表型的機(jī)制研究提供了依據(jù)，ANXA2基因有望成為膠質(zhì)瘤診斷和治療的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，本研究借助于生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)分析后發(fā)現(xiàn)，ANXA2是膠質(zhì)瘤中潛在的癌基因，篩選相關(guān)基因后進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，將獲得的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路基因進(jìn)行生存期分析和PPI分析，最終發(fā)現(xiàn)TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5是ANXA2參與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)鍵基因。