努色熱提·阿布都沙拉木 袁慕云 林曉峰 許龍巖★ 陳瑤★

沙門(mén)菌（Salmonella，Sa）屬于腸桿菌科，在世界各國(guó)細(xì)菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位［1-2］。沙門(mén)氏菌的血清型有超過(guò)2 500 中，腸炎沙門(mén)菌（Salmonella enteritidis，SE）和鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella typhimurium，ST）感染占到人類(lèi)Sa 感染患者的75%以上［3-4］。因此，快速鑒定并確定沙門(mén)氏菌的型別，對(duì)食品安全具有重要的意義。

目前沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法在快速發(fā)展中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展在一定程度上克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、特異性差等缺點(diǎn)。但是目前用于PCR 的核酸檢測(cè)參考品十分缺乏。要同時(shí)進(jìn)行沙門(mén)氏菌的鑒定和型別分析，往往要使用多個(gè)基因組參考品才能完成，而基因組參考品中檢測(cè)靶基因的量值，又難于確定和溯源［4-5］，也無(wú)法就不同實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和評(píng)價(jià)。為此，本實(shí)驗(yàn)擬制備含可用于鑒定和鑒別沙門(mén)氏菌型別的基因片段的質(zhì)粒DNA 參考樣品，為沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)提供可溯源的有效參考物質(zhì)，有效解決病原菌核酸檢測(cè)能力快速發(fā)展與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的矛盾。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

菌株來(lái)源為沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC50071），鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC14028），腸炎沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC13076）（來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心廣州海關(guān)技術(shù)中心）。全基因人工合成等（上海吉瑪生物工程有限公司）；引物合成、DNA 測(cè)序（華大基因科技股份有限公司）。

1.2 片段設(shè)計(jì)和克隆

通過(guò)人工合成的方法將沙門(mén)氏菌aceA基因（GenBank：U43344.1），SE 特異性序列se（Gen-Bank：AF370707.1），ST 特異性序列st（GenBank：CP001363.1）以1∶1 的比例串聯(lián)在一起（單個(gè)基因的核酸序列可從https：//www.ncbi.nlm.nih 下載，基因之間以不相關(guān)的基因片段aagtcg 隔開(kāi)），并克隆到pUC57 中以形成重組質(zhì)粒pDNASalmonella，并進(jìn)行擴(kuò)增純化后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 質(zhì)粒純度測(cè)定

使用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度分析法（UV 法）判定質(zhì)粒純度。取10 μL 酶切液上樣，用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察條帶是否清晰且單一以判斷核酸純度。取1 μL 樣品通過(guò)UV 法測(cè)出樣品在260 nm、280 nm 波段的紫外光下的吸光度值（A260、A280），純DNA 的A260/A280 應(yīng)為大于1.8，小于2.0 的值。

1.4 均勻性檢測(cè)

取樣按照《JJG1006-1994 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行使用紫外法（UV 法）（最小采樣量為1 μL）分析pNDA 的瓶間均勻度和瓶?jī)?nèi)均勻度。

隨機(jī)選擇10 管pDNA，并從每管樣品的上層，中層和下層提取1 μL 測(cè)試樣品，根據(jù)方差分析（F-測(cè)試）瓶?jī)?nèi)均勻性。隨機(jī)選擇10 管pDNA，并用UV 重復(fù)測(cè)量每管中提取的1 μL 樣品3 次，取平均值。通過(guò)方差分析（F 檢驗(yàn)法）分析測(cè)量結(jié)果并進(jìn)行判斷瓶間均勻性。并根據(jù)ISO 指南35 使用該數(shù)據(jù)評(píng)估pDNA 分裝導(dǎo)致的均勻性對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)。

1.5 穩(wěn)定性考察

選擇最常見(jiàn)的保藏方法-20℃低溫保存作為穩(wěn)定性考察的指標(biāo)，每月隨機(jī)抽取3 瓶對(duì)質(zhì)粒DNA參考物質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定，為期一年，并根據(jù)ISO指南35 使用該數(shù)據(jù)評(píng)估長(zhǎng)時(shí)間保存的穩(wěn)定性并評(píng)估穩(wěn)定性對(duì)核酸參考物質(zhì)不確定度的貢獻(xiàn)。

1.6 定值

pDNA 采用8 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)值的確定，匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)后經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確認(rèn)各組數(shù)據(jù)無(wú)離群值、各組數(shù)據(jù)等精度、每組數(shù)據(jù)的平均值之間不存在顯著性差異后，取8 家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的平均值為各質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值，并進(jìn)行定值過(guò)程引入的不確定度。

1.7 不確定度評(píng)估

根據(jù)對(duì)pDNA 均勻性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、定值結(jié)果這三方面來(lái)源的不確定度最終計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展相對(duì)不確定度。在計(jì)算擴(kuò)展不確定度的時(shí)候，將標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子（k=2）。

1.8 qPCR 實(shí)驗(yàn)

根據(jù)沙門(mén)氏菌基因組大小3.29 Mbp，pDNA 大小5 179 bp，按照以下公式估算基因組DNA 和重組質(zhì)粒DNA 的拷貝數(shù)。

定量后，使用pDNA 和gDNA 分別制備10 倍稀釋系列，制備2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和2×101copies/mL 稀釋的樣品用于建立qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。qPCR 每個(gè)反應(yīng)均含10 pM 引物。PCR 方案如下：分別在94℃下10 min 和94℃下15 s，在58℃下45 s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列和擴(kuò)增子大小如表1。

分別將質(zhì)粒參考品（pDNA）和基因組DNA（gDNA）稀釋成106、105、104、103、102和101copies/mL 用作參考樣品，并一式三份進(jìn)行qPCR 檢驗(yàn)，以估計(jì)qPCR 檢測(cè)的擴(kuò)增效率（e）和斜率（K）。以101拷貝為檢測(cè)樣本進(jìn)行10 次qPCR 檢測(cè)，以估計(jì)檢測(cè)下線（Limit of detection，LOD）來(lái)評(píng)估qPCR的檢測(cè)范圍。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率（e）和斜率（K），以評(píng)估pDNA 對(duì)gDNA 的可替換性。

1.9 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 12.0 和Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均勻性測(cè)試使用單因素方差分析。穩(wěn)定性分析使用單向線性回歸分析來(lái)計(jì)算斜率b1，當(dāng)|b1|＜t00.95，n-2×S（b1）時(shí)將認(rèn)定未觀察到不穩(wěn)定性［（n-2 是自由度），而S（b1）是斜率的不確定性］。使用配對(duì)t檢驗(yàn)分析pDNA 與gDNA 的適用性結(jié)果。當(dāng)P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)意義。

表1 三種沙門(mén)氏菌檢測(cè)所需的引物序列和來(lái)源Table 1 Sequence and source of Primers for salmonella

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

測(cè)序結(jié)果提示成功合成了含有基因的DNA片段，并將其插入克隆載體和pUC57 中，形成了重組質(zhì)粒pDNA（圖1）。pDNA 提取純化后，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒中插入片段的序列準(zhǔn)確度為100%，符合預(yù)期（圖2）。鑒定后的質(zhì)粒通過(guò)紫外法測(cè)定其A260/A280的比值為1.926±0.436，比值在1.8-2.0 間，且A260/A230的比值大于2.0。

圖1 pDNA Salmonella 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Figure 1 Map of plasmid reference material pDNA Salmonella

圖2 pDNA Salmonella 質(zhì)粒鑒定圖Figure 2 Identification of pDNA Salmonella

2.2 均勻性檢驗(yàn)

均勻性檢測(cè)結(jié)果顯示，在95%置信水平下，pDNA 的性質(zhì)值在瓶?jī)?nèi)和瓶?jī)?nèi)均質(zhì)性上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 鼠腸炎傷寒沙門(mén)氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Statistic results of homogenous test of pDNA Salmonella

根據(jù)以下公式計(jì)算質(zhì)粒DNA 的瓶間不均勻性引起的不確定度（uh）：

其中：Q1為組間差方和，Q2為組內(nèi)差方和，v1為組間自由度，v2為組內(nèi)自由度，n為組內(nèi)測(cè)量次數(shù)。

根據(jù)上述公式計(jì)算得出，pDNA 瓶間不均勻性引起的不確定度結(jié)果為：0.586 μg/mL。

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

pDNA 在-20℃低溫保存條件下用經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ途€性回歸模型進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的結(jié)果，結(jié)果表明穩(wěn)定性線性模型中的斜率|β1|＜t0.95，n-2·S（β1），表明pDNA 具有良好的穩(wěn)定性。根據(jù)以下公式計(jì)算質(zhì)粒DNA 在12 個(gè)月內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性引起的不確定度（us）。見(jiàn)表3。

表3 pDNA 長(zhǎng)期穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistic results of short-term stability of pDNA Salmonella

us=Sβ1×N

其中：β1是穩(wěn)定性線性模型中的斜率，S（β1）是斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，N 是穩(wěn)定性評(píng)估的總時(shí)間，N=12 個(gè)月最終經(jīng)過(guò)計(jì)算得出pDNA 在長(zhǎng)期保存12 個(gè)月所引起的不確定度為：1.616 μg/mL。

2.4 定值結(jié)果

pDNA 的參考值由8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室共同確定，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢查證實(shí)，每組數(shù)據(jù)均沒(méi)有異常值和顯著差異，并得出總的平均值=30.08 μg/mL 作為標(biāo)準(zhǔn)值；進(jìn)而根據(jù)以下公式計(jì)算定值過(guò)程帶來(lái)的不確定度：

其中：s 為總平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差1.016 μg/mL，p 為實(shí)驗(yàn)室數(shù)目。

因此得出由定值產(chǎn)生的不確定度結(jié)果為：0.359 2 μg/mL

2.5 不確定度分析

質(zhì)粒DNA 參考材料的不確定度成分為：均質(zhì)性（uh）、有效期內(nèi)變異性引起的不確定度（us）、定量過(guò)程引入的不確定度（uq），因此根據(jù)以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

結(jié)果為：1.796 6 μg/mL。計(jì)算擴(kuò)展不確定度時(shí)，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子（k=2）。所以，擴(kuò)展相對(duì)不確定度計(jì)按以下公式計(jì)算：

U=Ucrm*k

最終計(jì)算得到擴(kuò)展不確定度（U）為3.5932 μg/mL（k=2）。圖3。

2.6 熒光定量PCR（qPCR）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用所制備的pDNA 作為參照標(biāo)準(zhǔn)以建立qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)。見(jiàn)表4、圖3。

表4 沙門(mén)氏菌pDNA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 4 Data for the standard curve established by pDNA Salmonella

圖3 沙門(mén)氏菌pDNA 建立的aceA，st，se 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of aceA，st，se sequence established by pDNA Salmonella

2.7 pDNA 和基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的替代研究

此研究中使用了以梯度稀釋的傷寒沙門(mén)菌基因組DNA（gDNA）和pDNA 參考材料為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率和斜率（t 檢驗(yàn)）。在95%置信度下，基因組DNA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與pDNA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

為了能夠提供為多個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行定性定量參考的參考品，本研究針對(duì)沙門(mén)菌的aceA基因、腸炎沙門(mén)菌特異序列st、鼠傷寒沙門(mén)菌的特異性序列se，通過(guò)人工合成方法制備了質(zhì)粒核酸檢測(cè)參考品。pDNASalmonella的制備解決了需要鑒別沙門(mén)氏菌的型別的時(shí)候，需要使用多種基因組核酸參考品的問(wèn)題，通過(guò)一次熒光PCR 擴(kuò)增就可以確認(rèn)檢測(cè)樣本是否受到沙門(mén)菌以及哪一種沙門(mén)菌的污染。在提供有保障的序列和量值溯源的同時(shí)，大大簡(jiǎn)化了操作的繁瑣性［4-7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pDNASalmonella不僅具有序列和量值的可溯源性，還具有良好的穩(wěn)定性及均一性，符合《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》要求［8-10］。本文進(jìn)一步根據(jù)歐盟核酸參考品Yieldgard MON 810 的研究方 法［11-13］證明了pDNASalmonella替換基因組DNA 的可行性，提示在制備方法和安全性上具有巨大優(yōu)勢(shì)的人工合成質(zhì)粒DNA 參考品有望替代基因組參考品應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的核酸檢驗(yàn)。

表5 副溶血弧菌pDNA 和基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品代替性研究Table 5 Substitution of pDNA Salmonella and genomic DNA reference material

本研究為人工合成質(zhì)粒作為病原菌核酸檢測(cè)參考品的應(yīng)用提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。下一步工作，我們將進(jìn)一步驗(yàn)證此方法是否也可更廣泛的用于食品中其他危險(xiǎn)病原體的檢測(cè)，例如Ecoli O157，副溶血性弧菌和霍亂弧菌等，并希望通過(guò)提供優(yōu)質(zhì)的可溯源性參考品有效提高病原體測(cè)試實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)水平并確保其可比性，從而提高應(yīng)對(duì)大規(guī)模突發(fā)公共安全事件的能力儲(chǔ)備。