王苗，張紅印，范琳，張榮榕，馬馨桐，嚴(yán)銘銘*，邵帥*，趙大慶

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林 長春 130117；2.吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117）

葛根為豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]，是我國最常見的中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，葛根中含有的黃酮類成分葛根素對糖尿病、高血壓、高血脂和心腦血管等疾病有一定療效，葛根中總黃酮對中年婦女和絕經(jīng)婦女養(yǎng)生保健作用明顯。藥用價(jià)值極高的葛根，素有“亞洲人參”之美譽(yù)，2002年被國家原衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)為“藥食同源”植物，近年來，含葛根的食品及保健食品層出不窮，主要有葛根黃酮類功能食品、葛根低聚糖食品、葛根奶粉、葛根掛面、葛根軟糖等營養(yǎng)食品。

研究表明葛根除含有黃酮等功效成分外，還含有豐富的氨基酸，尤其是人體不能合成的必需氨基酸含量更高。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，所以對于葛根蛋白的研究十分有意義，但受蛋白提取率低的影響，目前關(guān)于葛根蛋白的研究很少。僅有文獻(xiàn)報(bào)道[3]利用Tris-HCl法提取粉葛蛋白，并沒對其功效進(jìn)行研究。

隨著近年來對于植物蛋白研究開發(fā)的重視，本研究在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以葛根為原料，通過堿提酸沉法提取葛根蛋白，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對葛根蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并對最優(yōu)條件下提取的葛根蛋白的抗氧化活性進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根：吉林省長春市同仁堂大藥房，產(chǎn)地河北省保定市，批號20190704，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定為豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：天根生化科技有限公司；硫酸銨、氫氧化鈉、98%濃鹽酸（均為分析純）：北京化工廠。

SKD-200型凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；DT5-2B型低速臺式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；KQ3200B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1700型紫外分光光度計(jì)：島津（上海）儀器有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機(jī)：EYELA東京理化器械株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 葛根提取物中蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)Bradfrod法測定葛根提取物中蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取 0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）補(bǔ)足到150μL。向各試管中加入2.85 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫（25℃）放置5 min，采用紫外分光光度計(jì)在595 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性回歸方程：y=0.013 3x+0.027 9，R2=0.999 7。葛根提取物中蛋白質(zhì)含量根據(jù)上述回歸方程求得。

1.2.2 提取率計(jì)算公式

1.2.3 葛根蛋白等電點(diǎn)測定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，稱取適量葛根藥材，按料液比1∶25（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至10，在水浴溫度45℃下浸提2.5 h，4 000 r/min離心，得上清液。上清液分別用1 mol/L HCl調(diào)pH值至1 ～7，靜置離心，收集沉淀，冷凍干燥后稱重，以pH值為橫坐標(biāo)，沉淀質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沉淀量最大處的pH值[4]即為葛根蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.4 不同提取方法比較

通過文獻(xiàn)查閱結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果制定出4種葛根蛋白提取方法，如下：

方法1[5]：葛根藥材→蒸餾水40℃浸提→離心（4 000 r/min，20 min）→上清液→硫酸銨分級沉淀→靜置→離心取沉淀（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸餾水透析、濃縮→冷凍干燥→葛根蛋白樣品。

方法2：葛根藥材→堿液浸提（加入NaOH→調(diào)pH值→置于恒溫水?。x心（4 000 r/min，20 min）→上清液→加HCl調(diào)pH值至等電點(diǎn)→離心（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸餾水透析、濃縮→冷凍干燥→葛根蛋白樣品。

方法3[6]：葛根藥材→70%乙醇浸提→振蕩1 h→離心（4 000 r/min，20 min）→上清液→鹽析→靜置→離心取沉淀（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸餾水透析、濃縮→冷凍干燥→葛根蛋白樣品。

方法4[7]：葛根藥材→加入50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-HCl→50℃浸提0.5h→離心（4000r/min，20min）→透析、濃縮→冷凍干燥→葛根蛋白樣品。

針對以上4條工藝路線，以葛根蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，篩選葛根蛋白最佳提取方法。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

以葛根蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)考察提取溫度（30、35、40、45、50 ℃）、提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3h）、料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]3個(gè)因素對葛根蛋白提取效果的影響。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[8]，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為自變量，提取率（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Box-Behnken response surface test factor level table

1.2.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

分離膠濃度為15%、濃縮膠濃度為5%，樣品和Marker上樣量均為20 μL。采用垂直板電泳，條件為濃縮膠電壓70 mV，分離膠電壓140 mV。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色至條帶清晰[9]。

1.2.8 葛根蛋白體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力測定

取不同濃度葛根蛋白溶液1mL于試管中，加入3mL 0.004% DPPH溶液，混勻于暗室反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1；空白組為1mL蒸餾水和3mL0.004% DPPH溶液，測定吸光度值A(chǔ)0；樣品對照組用3 mL甲醇代替DPPH溶液，測定吸光度值A(chǔ)2。以甲醇作為空白調(diào)零，VC作為陽性對照組[10]。清除率計(jì)算公式如下：

1.2.8.2 羥基自由基清除能力測定

取不同濃度葛根蛋白溶液1 mL于試管中，加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液和1.5 mL 0.2 mol/L PBS，混勻，再加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液，充分混勻，37℃水浴反應(yīng)1 h，在536 nm處測定吸光度值A(chǔ)1；正常組以2 mL蒸餾水代替1 mL樣品溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液，測定吸光度值A(chǔ)0；陰性組以1 mL蒸餾水代替樣品，測定吸光度值A(chǔ)2；樣品對照組以3mL蒸餾水代替1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 0.01% H2O2溶液，測定吸光度值A(chǔ)3。以蒸餾水作為空白調(diào)零，VC作為陽性對照[11]。清除率計(jì)算公式如下。

1.2.8.3 總還原能力測定

取1 mL不同濃度葛根蛋白于試管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS 和 2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，50℃水浴反應(yīng)20min，冷卻，加入2.5mL10%三氯乙酸，離心，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1% FeCl3溶液，搖勻，靜置，在700nm處測定吸光度值A(chǔ)1；以 2.5mL 蒸餾水代替 2.5mL1% K3Fe（CN）6溶液，其余步驟相同，測定吸光度值A(chǔ)2。以蒸餾水作為空白調(diào)零，VC作為陽性對照組[12]?？傔€原能力計(jì)算公式如下。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用軟件Origin 8.0進(jìn)行圖表制作，Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根蛋白等電點(diǎn)測定結(jié)果

葛根蛋白等電點(diǎn)測定結(jié)果見圖1。

圖1 葛根蛋白等電點(diǎn)測定Fig.1 Determination of isoelectric point of Pueraria lobata protein

當(dāng)pH值為3.5時(shí)，沉淀質(zhì)量最大。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面不帶電荷呈電中性，分子間的斥力減弱，容易受靜電引力[13]影響聚集而產(chǎn)生沉淀，所以葛根蛋白的等電點(diǎn)為3.5。

2.2 不同提取方法比較結(jié)果

以葛根蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，篩選葛根蛋白4種不同提取方法，結(jié)果見表2。

由表2篩選結(jié)果可知，方法2葛根蛋白提取率明顯高于其它方法，其原因可能是堿提酸沉法重現(xiàn)性好，有機(jī)溶劑易使蛋白失活[14]，鹽析法提取蛋白不充分[15]，故選擇方法2作為葛根蛋白提取優(yōu)選工藝。

表2 葛根蛋白不同提取工藝比較研究Table 2 Comparison of different extraction methods of Pueraria lobata protein

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 溫度對提取率的影響

溫度對提取率的影響如圖2所示。

圖2 溫度對葛根蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of Pueraria lobata protein

隨著溫度升高，葛根蛋白提取率隨之增加，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，葛根蛋白提取率達(dá)到最大值。而溫度繼續(xù)升高，曲線呈下降趨勢，主要原因是溫度過低時(shí)蛋白不能充分溶解在提取溶劑中，而溫度過高又極易引起蛋白質(zhì)的變性[16]。

2.3.2 提取時(shí)間對提取率的影響

提取時(shí)間對提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對葛根蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of Pueraria lobata protein

葛根蛋白提取率隨著提取時(shí)間延長，呈先增加后降低的趨勢。主要原因是提取時(shí)間延長，能促進(jìn)顆粒胞膜的破裂，有利于蛋白質(zhì)的析出。

圖4 料液比對葛根蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on extraction rate of Pueraria lobata protein

2.3.3 料液比對提取率的影響

料液比對提取率影響結(jié)果如圖4。

在溶劑體積較小時(shí)，葛根藥材提取不完全，導(dǎo)致蛋白提取率低。當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，葛根藥材能夠充分溶解，蛋白提取率達(dá)到最大值。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以葛根蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，對提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（C）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

通過Design-Expert V8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=-172.65+7.03A+9.26B+1.59C+0.06AB-6.68AC-0.17BC-0.08A2-1.92B2-0.02C2。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 The results of quadratic regression model for response surface

由方差分析結(jié)果可知，模型F值為34.45，P<0.000 1，表明該模型差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.113 7>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，即模型與試驗(yàn)的差異較小，可以說明其它因素對試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，殘差是由隨機(jī)誤差引起的，能充分反映各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與回歸模型擬合度良好，因此該模型可用來分析葛根蛋白提取工藝條件。

對模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，A、BC、C2對提取率的作用顯著（P<0.05），B、C、A2對提取率作用極顯著（P<0.01）。比較F值大小可知影響提取率的主次順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。

2.4.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析

運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件，分析響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，得到響應(yīng)面曲面圖，該圖形能直觀地反映各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，提取溫度和提取時(shí)間的等高線呈橢圓形，響應(yīng)面較陡，隨著提取溫度和提取時(shí)間的增加，提取率逐漸增高并達(dá)到極值，之后緩慢下降，表明二者交互作用較為顯著；提取時(shí)間與料液比的等高線密集，響應(yīng)面曲線陡峭，隨著提取時(shí)間與溶劑體積的增加，提取率越來越高，達(dá)到極值后逐漸下降，表明兩者之間交互作用顯著；提取溫度與溶劑體積的等高線密集，響應(yīng)面曲線陡峭，隨著提取溫度與溶劑體積的增加，提取率越來越高，達(dá)到極值后逐漸下降，表明兩者之間交互作用極顯著。

通過對回歸模型方程求解，得出葛根蛋白最佳提取工藝為：提取溫度47.06℃，提取時(shí)間2.18 h，料液比1∶21.50（g/mL），提取率為 11.99%。

圖5 響應(yīng)面與等高線分析圖Fig.5 Response surface and contour analysis diagram

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮實(shí)際情況，將響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝條件參數(shù)修正為：提取溫度45℃，提取時(shí)間2 h，料液比為1∶20（g/mL）。并對修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到葛根蛋白平均提取率為11.73%，與預(yù)測值相近。在此條件下，葛根蛋白含量可達(dá)到60.18%。說明模型能較好地預(yù)測葛根蛋白的提取率，優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.5 SDS-PAGE結(jié)果

通過優(yōu)選工藝得到的葛根蛋白的SDS-PAGE結(jié)果見圖6。

圖6 葛根蛋白SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of Pueraria lobata protein

由圖6可知，通過堿提酸沉法提取的兩批葛根蛋白樣品分子量主要集中在14.0 kDa ～43.0 kDa。

2.6 葛根蛋白體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

葛根蛋白的體外抗氧化活性結(jié)果見圖7。

由圖7（a）可知，在0.02 mg/mL ～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，葛根蛋白DPPH自由基清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率高達(dá)51.15%，但清除效果弱于陽性對照組VC，計(jì)算得到葛根蛋白清除DPPH自由基的IC50值為0.78 mg/mL。

圖7 不同評價(jià)方法測定葛根蛋白抗氧化活性Fig.7 Determination of antioxidant activity of Pueraria lobata protein by different evaluation methods

由圖7（b）可知，葛根蛋白對羥基自由基的清除能力在0.05 mg/mL至2.25 mg/mL的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)較為明顯的量效關(guān)系，當(dāng)其濃度達(dá)到2.25 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)到88.62%，清除能力與2.25 mg/mL VC相當(dāng)。通過計(jì)算可知葛根蛋白清除羥基自由基的IC50值為1.89 mg/mL。

亞鐵氰化鉀在酸性條件下與鐵離子反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在700 nm處總還原能力隨著溶液濃度變大，其吸光度值變大，則總還原能力越強(qiáng)。由圖7（c）可知，葛根蛋白的總還原能力雖然也隨著濃度的增大而增加，表明葛根蛋白具有一定還原能力，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但與陽性對照組VC相比，其還原能力較弱。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到葛根蛋白最佳提取工藝為：提取溫度 45℃，提取時(shí)間 2 h，料液比 1∶20（g/mL）。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葛根蛋白提取率為11.73%。葛根蛋白的SDS-PAGE結(jié)果表明，葛根蛋白分子量主要分布在14.0 kDa ～43.0 kDa。此外，通過體外抗氧化試驗(yàn)充分證明了葛根蛋白具有較強(qiáng)的DPPH自由基和羥基自由基清除能力，同時(shí)葛根蛋白還具有一定的還原能力。本研究可為葛根蛋白的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。