宋慧 秦倪 于彩霞 師朵 劉雯

[摘要] 目的 探討EB病毒（EBV）相關(guān)胃癌（EBVaGC）細(xì)胞中EBV編碼的核抗原1（EBNA1）對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）表達(dá)的調(diào)控作用，并分析EBNA1和E2F1在胃癌細(xì)胞的表達(dá)情況。

方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）以及Western blotting方法，檢測(cè)EBVaGC和EBV陰性胃癌（EBVnGC）細(xì)胞中EBNA1和E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)水平;選取兩種EBVnGC細(xì)胞BGC823和SGC7901，建立EBNA1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型，命名為BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1，采用qRT-PCR方法和Western blotting方法檢測(cè)兩種細(xì)胞中E2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果 qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，EBNA1只在EBVaGC細(xì)胞中表達(dá)。EBVaGC細(xì)胞的E2F1 mRNA表達(dá)水平明顯高于EBVnGC細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.60，P<0.01）;而兩種細(xì)胞的E2F1蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性（P>0.05）。在EBVnGC細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。

結(jié)論 EBV編碼EBNA1誘導(dǎo)E2F1表達(dá)上調(diào)，提示E2F1可能在EBVaGC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。靶向EBNA1/E2F1途徑可能為EBVaGC病人的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 皰疹病毒4型，人;胃腫瘤;EBV編碼的核抗原1;E2F轉(zhuǎn)錄因子1

[中圖分類號(hào)] R373.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）06-0860-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.166

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210909.1515.005.html;2021-09-09 18：14：34

EFFECT OF EBNA1 ON E2F1 EXPRESSION IN EBV-ASSOCIATED GASTRIC CARCINOMA CELLS

SONG Hui， QIN Ni， YU Caixia， SHI Duo， LIU Wen

（Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To explore the regulatory effect of Epstein-Barr nuclear antigen 1 （EBNA1） encoded by Epstein-Barr virus （EBV） on the expression of E2F transcription factor 1 （E2F1） in EBV-associated gastric carcinoma （EBVaGC） cells， and to analyze the expression of EBNA1 and E2F1 in gastric carcinoma cells.

Methods Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels of EBNA1 and E2F1 in EBVaGC and EBV-negative gastric carcinoma （EBVnGC） cells. Two types of EBVnGC cells， BGC823 and SGC7901， were selected to establish cell models of stable EBNA1 expression， which were named BGC823-EBNA1 and SGC7901-EBNA1， respectively; qRT-PCR and Western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels of E2F1 in the cells.

Results The qRT-PCR and Western blotting results showed that EBNA1 was expressed only in EBVaGC cells. The mRNA expression level of E2F1 in EBVaGC cells was significantly higher than that in EBVnGC cells （t=13.60，P<0.01）， while there was no significant difference in E2F1 protein expression level between the two types of cells （P>0.05）. After stable EBNA1 overexpression in EBVnGC cells， the mRNA and protein expression levels of E2F1 were significantly upregulated.

Conclusion EBV-encoded EBNA1 induces upregulation of E2F1 expression， which suggests that E2F1 may play an important role in the development and progression of EBVaGC. Targeting the EBNA1/E2F1 pathway may provide a new therapeutic target for EBVaGC patients.

[KEY WORDS]herpesvirus 4， huaman; stomach neoplasms; EBV-encoded nuclear antigen 1; E2F transcription factor 1

EB病毒（EBV）是一種普遍存在的γ皰疹病毒，世界上絕大多數(shù)人都曾感染EBV并獲得適應(yīng)性免疫。1964年，EBV首先在伯基特淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤相關(guān)，包括霍奇金淋巴瘤、未分化的鼻咽癌以及10%左右的胃癌 [2]。EBV在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)多種潛伏基因，其中EBV編碼的核抗原1（EBNA1）是唯一一個(gè)在所有EBV相關(guān)腫瘤細(xì)胞中都表達(dá)的潛伏基因。EBNA1可以與多種細(xì)胞蛋白相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，并且對(duì)維持EBV的潛伏感染狀態(tài)起著重要作用。2014年，癌癥基因組圖譜（TCGA）將胃癌分為了4種分子亞型：EB病毒相關(guān)胃癌（EBVaGC）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（MSI）、染色體不穩(wěn)定型（CIN）和基因組穩(wěn)定型（GS）等[3]。EBVaGC的單獨(dú)分類顯示其具有獨(dú)特的致癌機(jī)制，并提供了將EBV用作靶向治療胃癌的新生物標(biāo)志物的機(jī)會(huì)。

E2F轉(zhuǎn)錄因子于1986年被首次發(fā)現(xiàn)，可與腺病毒E2啟動(dòng)子相互作用[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)8個(gè)E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員（E2F1～8），其中大多數(shù)與控制細(xì)胞周期有關(guān)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞分化、凋亡和DNA損傷等也發(fā)揮重要作用。E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）是第一個(gè)被鑒定的E2F家族成員，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRB）可與 E2F1相結(jié)合，進(jìn)而抑制其活性[5]。多項(xiàng)研究顯示，E2F1在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，如肺癌、乳癌、前列腺癌等[6-8]。E2F1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。然而，在胃癌中EBV對(duì)E2F1的調(diào)控及其作用機(jī)制，以及E2F1在胃癌中發(fā)揮的作用目前尚不明確。本文構(gòu)建EBNA1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型，檢測(cè)EBVaGC細(xì)胞、EBV陰性胃癌細(xì)胞（EBVnGC）及EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，探討E2F1在EBVaGC中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究采用了EBVaGC細(xì)胞系GT38、GT39和SNU719以及EBVnGC細(xì)胞系SGC7901、AGS和BGC823。所有的細(xì)胞系均加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含有體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自德國(guó)Invitrogen公司;RIPA裂解液、SDS-loading buffer購(gòu)自北京康為世紀(jì)科技有限公司;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;FastStart Essential DNA Green Master購(gòu)自德國(guó)Roche公司;Anti-EBNA1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司;Anti-E2F1抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;Anti-β-actin抗體、HRP標(biāo)記的兔IgG和鼠IgG抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Light Cycler 96熒光定量PCR儀（SN10700型，瑞士Roche公司）;SDS-PAGE垂直板型電泳儀、濕式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Quantum-ST5型（凝膠成像系統(tǒng)，法國(guó)Vilber Lourmat公司）。

1.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EBNA1的細(xì)胞模型

選取EBVnGC細(xì)胞系BGC823和SGC7901，采用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染EBNA1重組質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒（NC），轉(zhuǎn)染24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。待細(xì)胞匯合度至90%左右時(shí)，采用1 g/L的嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩(wěn)定表達(dá)EBNA1的細(xì)胞，直至熒光細(xì)胞含量90%以上。收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)EBNA1蛋白表達(dá)水平。EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞模型分別命名為BGC823-EBNA1及其對(duì)照BGC823-NC、SGC7901-EBNA1及其對(duì)照SGC7901-NC。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)EBNA1和E2F1 mRNA表達(dá)

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用First Strand cDNA合成試劑盒，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用FastStart Essential DNA Green Master對(duì)cDNA進(jìn)行qRF-PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL，其內(nèi)含有：Faststart Essential DNA Green Master Mix 10.0 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，RNase free water 8.0 μL，cDNA 1.0 μL。引物及其序列見(jiàn)表1。所有反應(yīng)均在LightCycler96系統(tǒng)進(jìn)行。采用2-△△Ct法分別計(jì)算EBNA1和E2F1基因相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t=△Ct 實(shí)驗(yàn)組-△Ct 對(duì)照組，2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)差異的倍數(shù)。

1.5 Western blotting方法檢測(cè)EBNA1和E2F1蛋白表達(dá)

用含有體積分?jǐn)?shù)0.10的苯甲磺酰氟（PMSF）和體積分?jǐn)?shù)0.10的廣譜磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白與5×的SDS-PAGELoading Buffer混合后沸水煮5 min。然后以每孔25 μg的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上。用50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，應(yīng)用TBST洗3次，一抗孵育4 ℃過(guò)夜。將孵育盒取出，一抗平衡室溫30 min后，應(yīng)用TBST洗3次， 室溫二抗孵育2 h，以ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種細(xì)胞EBNA1和E2F1表達(dá)比較

qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)顯示，所有EBVaGC細(xì)胞均表達(dá)EBNA1，而EBVnGC細(xì)胞不表達(dá);E2F1 mRNA在EBVaGC細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于EBVnGC細(xì)胞，差異有顯著性（t=13.60，P<0.01）;而E2F1蛋白在EBVaGC和EBVnGC細(xì)胞的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.757，P>0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

2.2 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞鑒定

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，EBNA1蛋白在BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而對(duì)照組細(xì)胞則不表達(dá)，證明EBNA1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型已經(jīng)成功建立。見(jiàn)圖2、表3。

2.3 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中E2F1的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有顯著性（t=9.939、14.080，P<0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（t=6.222、4.681，P<0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

3 討論

EBV是第一種被確定的人類腫瘤相關(guān)的病毒，在不同的腫瘤中具有不同的潛伏感染狀態(tài)并表達(dá)不同的潛伏期基因。普遍認(rèn)為EBVaGC中EBV介于Ⅰ型和Ⅱ型潛伏之間[9]，其中確定表達(dá)的病毒潛伏基因包括EBNA1和EBERs，也有部分病例可能表達(dá)LMP1或LMP2A[10-11]。EBNA1是第一個(gè)被報(bào)道的EBV潛伏期蛋白，并在所有類型的潛伏細(xì)胞中都表達(dá)，對(duì)EBV基因組的穩(wěn)定存在起著重要的作用[12]，并通過(guò)與病毒附加體中特定DNA序列的相互作用激活其他EBV潛伏基因的表達(dá)。EBNA1也可以與多種細(xì)胞蛋白相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和腫瘤形成，提示EBNA1對(duì)EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用。EBVaGC約占胃癌病例的10%，是所有EBV相關(guān)腫瘤中病人數(shù)量最多的疾病[13]。EBVaGC具有獨(dú)特的分子特征，例如較高的DNA超甲基化發(fā)生率、程序性死亡配體1（PD-L1）的過(guò)表達(dá)、PIK3CA和ARID1A突變顯著增加和免疫浸潤(rùn)增加等[14]。多項(xiàng)研究表明，EBV感染的胃癌細(xì)胞中EBNA1表達(dá)為宿主細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)能力和轉(zhuǎn)化潛能提供了便利，包括逃避免疫監(jiān)視、降低對(duì)DNA損傷的反應(yīng)或通過(guò)抑制野生型P53蛋白表達(dá)降低凋亡應(yīng)激刺激敏感性等[15]。但是，EBNA1在EBVaGC中發(fā)揮的作用及其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

E2F轉(zhuǎn)錄因子是多種細(xì)胞事件的重要參與者，包括細(xì)胞周期、DNA合成、DNA修復(fù)和核轉(zhuǎn)錄等。E2F1是E2F家族中研究最多的成員，其通過(guò)調(diào)節(jié)編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[16-17]。有趣的是，E2F1可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境不同作為癌基因或者抑癌基因來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生[18-19]。E2F1的激活是致癌病毒促進(jìn)細(xì)胞增殖的常見(jiàn)策略，并且其在EBV中已經(jīng)得到證實(shí)。

1991年，腺病毒E1A基因的產(chǎn)物被證明與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白（Rb）相互作用[20]。此后研究也表明，Rb可與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合[21]。在鑒定了所有不同形式的E2Fs后[22]，E2F1被認(rèn)為是主要的Rb結(jié)合細(xì)胞蛋白[23]。E2F1蛋白的功能受視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b的調(diào)節(jié)。當(dāng)Rb為非高磷酸化形式時(shí)，它通過(guò)其口袋結(jié)構(gòu)域與E2F1結(jié)合，并抑制E2F1的序列特異性DNA結(jié)合[24-25]。

在伯基特淋巴瘤中，在核糖體活性失調(diào)的情況下，EBNA1可通過(guò)激活E2F1來(lái)恢復(fù)核糖體的活性，而不依賴于pRb[25]。EBNA3C也可以在非Rb依賴性途徑中，通過(guò)募集E2F6到E2F1的啟動(dòng)子來(lái)下調(diào)E2F1的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖[26]。另外有研究結(jié)果證明，EBNA3C可促進(jìn)S18-2與pRb的結(jié)合，提高游離E2F1水平[27]。有研究顯示，胃癌病人E2F1表達(dá)顯著增加，E2F1可促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，且其高表達(dá)與胃癌病理分期差、腫瘤變大及預(yù)后更差呈正相關(guān)[28]?；谝陨涎芯?，本文在EBVaGC細(xì)胞中進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)探討EBNA1和E2F1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果顯示，EBVaGC細(xì)胞中E2F1的mRNA表達(dá)較EBVnGC細(xì)胞增高，但蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性;與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。表明胃癌細(xì)胞中外源性EBNA1表達(dá)可促進(jìn)E2F1的轉(zhuǎn)錄及翻譯，并可能通過(guò)影響E2F1表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤形成。EBVaGC細(xì)胞和EBVnGC細(xì)胞中E2F1蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性，這可能是多種因素共同作用的結(jié)果，EBNA1對(duì)其表達(dá)的調(diào)控只是其中一個(gè)方面，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，EBNA1可能通過(guò)上調(diào)E2F1的表達(dá)，從而促進(jìn)EBVaGC的發(fā)生發(fā)展。闡明EBV介導(dǎo)的腫瘤生成的具體機(jī)制，有助于E2F1高表達(dá)胃癌病人的臨床治療，擴(kuò)大治療效益。因此，EBNA1對(duì)E2F1表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制以及E2F1在胃癌中的生物學(xué)功能有進(jìn)一步研究的意義。對(duì)EBV編碼EBNA1調(diào)控E2F1表達(dá)的研究可能為EBV相關(guān)腫瘤的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）