郭亞格， 李珺沬*， 劉圓圓， 馬振宇

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017)

近年來(lái)，隨著工業(yè)化的快速發(fā)展以及經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，環(huán)境污染問(wèn)題日漸加劇，從而導(dǎo)致咳嗽、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1,2]。中成藥具有作用緩和、毒副反應(yīng)相對(duì)較小、療程長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此非常適合于咳嗽、哮喘等慢性疾病的治療[3,4]。然而，一些商家為了謀取暴利，向中成藥中非法添加某些化學(xué)成分，以達(dá)到起效快、療效顯著的目的[5 - 7]。由于這些非法添加的化學(xué)藥物種類(lèi)和含量的不確定性，如果患者在不知情的情況下長(zhǎng)期服用此類(lèi)藥物，可能由于攝入過(guò)量，發(fā)生毒副反應(yīng)，嚴(yán)重危害身體健康以及生命安全[8,9]。因此，有必要對(duì)止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中非法添加的化學(xué)成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

目前，對(duì)于止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中添加的化學(xué)成分的測(cè)定方法主要有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]等。離子遷移譜技術(shù)(Ion Mobility Spectrometry,IMS)[13 - 15]是基于不同的氣相離子在電場(chǎng)中遷移速度的差異而對(duì)帶電離子進(jìn)行表征的一種分析技術(shù)，具有專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)速度快，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查等特點(diǎn)，尤其是電噴霧電離(Electrospray Ionization,ESI)與IMS技術(shù)的結(jié)合，使IMS的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大到藥品[16]、食品[17]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[18，19]等領(lǐng)域。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道將電噴霧電離-離子遷移譜(ESI-IMS)應(yīng)用于中藥中指標(biāo)成分或非法添加物的分析[6,20]。然而，將該方法應(yīng)用于止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中非法添加化學(xué)成分的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用微波提取(MAE)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合ESI-IMS技術(shù)建立了止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中非法添加的4種化學(xué)成分鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新的快速篩查。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速分析，同時(shí)也為監(jiān)管部門(mén)監(jiān)測(cè)藥品及保健品中的非法添加物提供了一種強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GA2100高效離子遷移譜儀，配有電噴霧離子源，VisIon Analysis分析軟件(美國(guó)，Excellims公司)，進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣。高效液相色譜儀，配有L-6200A三元泵(日本，日立公司)，785A紫外檢測(cè)器(美國(guó)，Applied Biosystems公司)。MDS-6G型多通量微波消解/萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)。

鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新對(duì)照品購(gòu)自北京萊耀生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)CNW公司)；超純水(Milli-Q50系統(tǒng)制備)。

樣品：復(fù)方羅漢果止咳顆粒；益肺止咳膠囊；固本咳喘片；百貝益肺膠囊；民間偏方1(膠囊，組方未知)；民間偏方2(片劑，組方未知)。

1.2 溶液配制

1.2.1 對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用90%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含上述對(duì)照品溶液濃度分別為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、2 mL、0.5 mL和1 mL于10 mL容量瓶中，用90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試品溶液取藥品顆粒、膠囊(去殼)或片劑(去包衣)，于研缽中研細(xì)，精密稱(chēng)定各藥品粉末約0.1 g，置于微波萃取罐中，加90%甲醇10 mL，于110 ℃下600 W微波提取5 min，冷卻，過(guò)濾。精密吸取續(xù)濾液1 mL于10 mL量瓶中，用90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3 ESI-IMS工作條件

電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)，源電壓：2.5 kV，遷移管電壓：8.5 kV，遷移管溫度：160 ℃，進(jìn)氣口溫度：160 ℃，門(mén)電壓：60 V，門(mén)寬度：100 μs。排出氣流量：1.25 L/min，遷移氣流量：1.25 L/min。

1.4 高效液相色譜(HPLC)工作條件

色譜柱：C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm；日本Shimadzu公司)。流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液(含0.2%三乙胺，用H3PO4調(diào)節(jié)pH=3.0)(5∶95,V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 ESI-IMS工作條件的優(yōu)化

2.1.1 源電壓的優(yōu)化源電壓對(duì)待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度具有重要影響。源電壓過(guò)低，待測(cè)組分難以發(fā)生電離，源電壓太高，由于溶劑分子等其它組分與待測(cè)組分發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)電離而導(dǎo)致待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度降低。本實(shí)驗(yàn)考察了源電壓在2.0～3.0 kV范圍內(nèi)對(duì)待測(cè)組分響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，隨著源電壓的升高，各待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)源電壓為2.5 kV時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大值，結(jié)果如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)選擇最佳源電壓為2.5 kV。

2.1.2 遷移管電壓的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)在7.5～8.5 kV范圍內(nèi)對(duì)遷移管電壓進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，響應(yīng)強(qiáng)度隨著遷移管電壓的增加而增大，當(dāng)遷移管電壓為8.5 kV時(shí)，各待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大，結(jié)果如圖2所示。本實(shí)驗(yàn)選擇遷移管電壓為8.5 kV進(jìn)行后續(xù)分析測(cè)定。

圖1 源電壓對(duì)強(qiáng)度的影響Fig.1 The effect of source voltage on intensity

圖2 遷移管電壓對(duì)強(qiáng)度的影響Fig.2 The effect of drift tube voltage on intensity

2.1.3 遷移管溫度的優(yōu)化提高遷移管溫度，可以有效減少遷移管內(nèi)的記憶效應(yīng)，從而提高檢測(cè)靈敏度，而遷移管溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致熱交換加速、待測(cè)組分分解等一系列不穩(wěn)定因素，從而使峰形展寬，響應(yīng)信號(hào)降低。本實(shí)驗(yàn)考察了不同遷移管溫度(150、160、170、180 ℃)對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)遷移管溫度為160 ℃時(shí)，各待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度最大，如圖3所示。本實(shí)驗(yàn)選擇遷移管溫度為160 ℃。

2.1.4 進(jìn)氣口溫度的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)考察了進(jìn)氣口溫度在150～180 ℃對(duì)各待測(cè)組分響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)氣口溫度的升高，各待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)溫度為160 ℃時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度最高，之后繼續(xù)提高進(jìn)氣口溫度，各待測(cè)組分的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸降低，如圖4所示。本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)氣口溫度為160 ℃。

圖3 遷移管溫度對(duì)強(qiáng)度的影響Fig.3 The effect of drift tube temperature on intensity

圖4 進(jìn)氣口溫度對(duì)強(qiáng)度的影響Fig.4 The effect of gas inlet temperature on intensity

2.2 進(jìn)樣溶劑的優(yōu)化

在ESI-IMS中，待測(cè)組分在電噴霧離子源的作用下轉(zhuǎn)化為帶電離子，因此要求進(jìn)樣溶劑具有一定的導(dǎo)電性以提高待測(cè)組分的離子化效率。本實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇和乙腈作為進(jìn)樣溶劑進(jìn)行分析，結(jié)果表明，兩種溶劑對(duì)待測(cè)組分響應(yīng)強(qiáng)度的影響相差不大，但乙腈作為溶劑時(shí)，基線(xiàn)噪聲較大，因此選擇甲醇作為進(jìn)樣溶劑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同濃度(60%、70%、80%、90%、100%)的甲醇水溶液對(duì)響應(yīng)信號(hào)的影響，結(jié)果顯示，待測(cè)組分在90%甲醇溶液中響應(yīng)最好，且基線(xiàn)平穩(wěn)，因此最終選擇90%甲醇溶液作為進(jìn)樣溶劑。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了MAE與傳統(tǒng)提取方法，如索氏提取和超聲提取對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明3種提取方式對(duì)4種待測(cè)組分的提取效率相差不大，但與傳統(tǒng)提取方法相比，MAE所用時(shí)間顯著縮短(表1)。這是由于微波是一種超高頻率的電磁波，具有很強(qiáng)的穿透力，它能夠通過(guò)離子的偶極作用均勻、快速地對(duì)待測(cè)樣品和溶劑的內(nèi)部和外部同時(shí)加熱，使分子的平均動(dòng)能增加，從而縮短提取時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率[21]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇MAE對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

表1 MAE和其它傳統(tǒng)提取方法的比較(n=5)Table 1 Comparison of MAE with other traditional extraction methods(n=5)

實(shí)驗(yàn)對(duì)MAE的主要參數(shù)，如功率(400～1 000 W)、溫度(90～150 ℃)和時(shí)間(1～10 min)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，待測(cè)組分在110 ℃下600 W提取5 min時(shí)，提取效率達(dá)到最佳。本實(shí)驗(yàn)選擇上述條件對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行提取。

2.4 遷移時(shí)間的重復(fù)性考察

ESI-IMS主要通過(guò)遷移時(shí)間的差異對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離和定性，因此，遷移時(shí)間的重復(fù)性對(duì)測(cè)定結(jié)果具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)待測(cè)組分在低、中、高3個(gè)濃度溶液中的遷移時(shí)間進(jìn)行考察，每個(gè)濃度測(cè)定5次，每次間隔30 min，結(jié)果顯示鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新的遷移時(shí)間分別為9.193±0.013 ms、10.327±0.014 ms、11.720±0.009 ms和12.432±0.010 ms，表明4種組分的遷移時(shí)間重現(xiàn)性良好。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

在ESI-IMS分析中，樣品基質(zhì)可能對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)高效液相色譜法驗(yàn)證為陰性的復(fù)方羅漢果止咳顆粒作為空白對(duì)照樣品，考察基質(zhì)對(duì)4種待測(cè)組分的干擾情況。將復(fù)方羅漢果止咳顆粒按照“1.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)溶液。分別用90%甲醇和空白基質(zhì)溶液稀釋混合對(duì)照品溶液，以“1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，按下列公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)(%)=(空白基質(zhì)配制加標(biāo)溶液響應(yīng)值/90%甲醇配制加標(biāo)溶液響應(yīng)值)×100%。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)對(duì)4種待測(cè)組分的測(cè)定不存在明顯的基質(zhì)干擾，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略(表2)。

表2 4種待測(cè)組分的基質(zhì)效應(yīng)(n=5)Table 2 Results of matrix effect for 4 analytes(n=5)

2.6 方法學(xué)考察

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥上盗袧舛鹊木€(xiàn)性對(duì)照品溶液。按“1.3”項(xiàng)下ESI-IMS工作條件進(jìn)樣測(cè)定，以各待測(cè)組分的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(c，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)。分別以信噪比(S/N)=3和S/N=10計(jì)算，得到方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果如表3所示。

表3 方法的線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和檢出限Table 3 Linear relationship and limit of detection

分別精密量取低、中、高3個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品溶液適量，置微波萃取罐中，揮干溶劑，精密加入經(jīng)高效液相色譜法確認(rèn)不含有4種待測(cè)化學(xué)成分的復(fù)方羅漢果止咳顆粒細(xì)粉0.1 g，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)供試品溶液，每個(gè)濃度制備5份，按“1.3”項(xiàng)下ESI-IMS工作條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表4所示。

表4 4種待測(cè)組分的加標(biāo)回收率(n=5)Table 4 Results of recovery for 4 analytes(n=5)

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建立的方法對(duì)4種中成藥和2種民間偏方進(jìn)行分析，結(jié)果1種民間偏方(片劑)檢測(cè)出含有鹽酸麻黃堿，如圖5所示。其它樣品中未見(jiàn)4種待測(cè)組分檢出。 將陽(yáng)性樣品溶液用高效液相色譜法進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明ESI-IMS法的測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法(HPLC)一致，如圖6所示。

圖5 混合對(duì)照品溶液(a)和陽(yáng)性樣品溶液(b)的ESI-MIS圖Fig.5 ESI-IMS of standards(a) and positive sample(b) 1.ephedrine hydrochloride;2.guaifenesin;3.chlorpheniramine;4.bromhexine hydrochloride.

圖6 鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(a)和陽(yáng)性樣品溶液(b)的HPLC圖Fig.6 Chromatograms of ephedrine hydrochloride standard(a) and positive sample(b)1.ephedrine hydrochloride.

3 結(jié)論

本研究采用MAE技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合ESI-IMS技術(shù)建立了止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中非法添加的4種化學(xué)成分鹽酸麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚、馬來(lái)酸氯苯那敏和鹽酸溴己新的快速篩查方法。該方法快捷高效(只需5 min即可完成樣品前處理，30 s內(nèi)完成測(cè)定)、檢測(cè)成本低、靈敏度高。通過(guò)對(duì)4種中成藥和2種民間偏方進(jìn)行篩查，其中，1種民間偏方(片劑)檢測(cè)出鹽酸麻黃堿，與產(chǎn)品宣傳(純中藥組方)不符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法適合于止咳平喘化痰類(lèi)中成藥中非法添加化學(xué)成分的快速篩查，同時(shí)也為其它藥品及保健品中的非法添加物的監(jiān)測(cè)提供了一種有效的分析手段。